Оценка аллергизирующих свойств препарата Дон-1 в общем дизайне доклинических токсикологических исследований

Развитие ветеринарного фармацевтического рынка в условиях санкционной политики и дефицита отечественных лекарственных средств в последнее время становится одним из ключевых отраслевых приоритетов государственной политики Российской Федерации. В этом случае, с появлением новых средств профилактики и терапии заболеваний животных, возникает необходимость в разработке программы доклинических исследований, включающих продуманную и обоснованную оценку всех возможных токсических или побочных эффектов лекарственного вещества с учетом его специфического действия. При этом в обязательный дизайн исследований входит оценка аллергизирующих свойств новых ЛС на лабораторных животных, характеризующих гиперчувствительность и развитие побочных реакций [4, 6].

Проблема лекарственной аллергии заключается еще и в том, что зачастую невозможно точно спрогнозировать аллергические реакции, исходя из структуры, молекулярной массы и механизмов действия лекарственного средства или химического соединения. Поэтому оценка аллергоопасности новых лекарственных соединений и сложных продуктов на их основе должна проводиться исходя из условий предполагаемого применения и возможного повреждающего действия на кожные покровы и слизистые оболочки подопытных животных [3, 5].

К наиболее распространенным аллергодиагностическим методам относится метод эпикутанной сенсибилизации, проявляющий признаки контактной аллергии и имеющий многочисленные корреляции на чувствительных лабораторных животных, а также метод конъюнктивальной пробы, являющийся очень чувствительным тестом и в ряде случаев позволяющий выявить реакцию животных на аллерген при слабой аллергизации и отрицательных кожных тестах [2, 7].

С учетом сказанного, нами были проведены исследования по оценке потенциальных аллергических и токсических свойств препарата ДОН-1, лекарственная форма которого представляет подвижную сиропообразную жидкость, красно-желтого цвета с острым кислым запахом, применяемую для внесения в водоем при разведении и выращивании рыбы в прудах и бассейнах. В качестве активных веществ препарат содержит кротонолактон и органические кислоты (янтарную, фумаровую, малеиновую), растворенные в воде [1].

Материал и методы исследования. Изучение аллергизирующих свойств препарата ДОН-1 проводилось согласно «Методических рекомендаций по оценке аллергизирующих свойств фармакологических средств N 98/300» (1988). Исследования проведены в два этапа – на морских свинках и кроликах породы Серый великан, включающих проведение экспресс-сенсибилизации кожных покровов и выявление раздражающего действия тестируемого образца препарата ДОН-1 на слизистые оболочки глаза.

На первом этапе в опыте участвовали морские свинки с массой тела 350-400 г (n=6), которым на заранее выстриженную поверхность верхней трети спины в нативном виде наносился раствор препарата при четырехчасовой индукционной экспозиции с последующим тщательным промыванием тестируемых участков кожи водой (Рисунок 1-2).

Рисунок 1 – Нанесение раствора образца препарата ДОН-1 на кожную поверхность

Рисунок 2 – Экспозиция раствора образца препарата ДОН-1 на поверхности кожи морской свинки морской свинки

Кожная реакция учитывалась сразу же после удаления препарата, а также в последующие сутки экспериментального периода путем сравнительного анализа с реакцией контрольных животных (n=3), которые не подвергались воздействию провокационной дозы препарата ДОН-1. При оценке возможных повреждений оценивались показатели, характерные для развития контактного дерматита: эритема, отек, наличие повреждений, трещин, изъязвлений,     повышение     местной температуры по следующей шкале:

– отсутствие видимой реакции – 0 баллов;

– слабо розовая эритема по всему участку или по периферии – 1 балл;

– ярко розовая эритема по всему участку или по периферии – 2 балла;

– ярко красная эритема по всему участку –3 балла;

– опухание кожи с эритемой или без нее – 4 балла;

– выраженное опухание, очаговые изъязвления, геморрагии – 5 баллов.

Далее,    по    среднегрупповым показателям используемых в эксперименте животных, оценивалась частота развития сенсибилизации и ее интенсивность.

На втором этапе    оценка аллергического действия препарата ДОН-1 проводилась                постановкой конъюнктивальной пробы, для чего кроликам (n=3) с массой тела 3,5–3,9 кг в положении лежа вниз головой под верхнее веко левого глаза пипеткой с вытянутым тонким концом вводилось по 1 капле 20 %-ного раствора препарата (Рисунок 3).

Для контроля одновременно этим же животным в правый конъюнктивальный мешок вносилось по 1 капле дистиллированной воды. После внесения растворов у внутреннего угла глаза кроликов на минуту прижимался слезоносовой канал. Учет реакции проводился через 5,15 минут, 2 и 24 часа по следующим показателям: внешний вид склеры, роговицы, конъюнктивы; наличие гиперемии на склере и конъюнктиве; характер и количество секрета слезных желез. Клиническое и аллергологическое состояние животных оценивалось по бальной шкале:

– отсутствие видимой реакции – 0 баллов;

– легкое покраснение слезного протока – 1 балл;

– гиперемия слезного протока и склеры в направлении к роговице – 2 балла;

– гиперемия всей конъюнктивы и склеры

– 3 балла;

– наличие лакримации и выделений – 4 балла;

– отек и изъязвления конъюнктивы и склеры – 5 баллов.

Результат         исследований.

Установлено, что однократное нанесение образца препарата ДОН-1 на кожные покровы морских свинок не выявило достоверных различий по реакции кожных проб, что может свидетельствовать об отсутствии аллергической сенсибилизирующей активности препарата (Рисунок 4). По шкале реакции в баллах была выставлена оценка 0 – отсутствие видимой реакции.

Рисунок 3 – Введение образца препарата ДОН-1 в конъюнктивальный мешок глаза кролика

Рисунок 4 – Отсутствие повреждений и местной кожной аллергической реакции у морской свинки на месте нанесения образца препарата ДОН-1

При оценке конъюнктивальной пробы установлено, что сразу же после введения образца препарата ДОН-1 у животных отмечалась выраженная болезненность, смыкание век, повышенная слезоточивость и беспокойство. Признаки поражения слизистой и конъюнктивы глаз нарастали, что проявилось помутнением роговицы, развитием кератоконъюнктивита и блефарита (Рисунки 5-6).

Через 5 минут после введения раствора препарата ДОН-1 животным было проведено обильное промывание глаз проточной водой, однако признаки поражения не ослабели и через 15 минут был зафиксирован значительный отек конъюнктивы, блефарит, помутнение роговицы. В течение всего дня отмечались частичное смыкание век, слезотечение, гиперемия конъюнктивы, болезненность и отёчность вспомогательного аппарата глаза. Через сутки после проведения теста смыкание век и отечность глаза уменьшились, животные продолжали щуриться, но болезненность, беспокойство и слезоточивость снизились (Рисунок 7).

Рисунок 5 – Помутнение роговицы глаза кролика

Рисунок 6  – Развитие блефарита и

конъюнктивита

Рисунок 7 – Состояние глаза кролика через 24 ч после введения опытного образца препарата ДОН-1

Следует отметить, что в данном случае препарат ДОН-1 в большей степени оказал не аллергическое воздействие, а вызвал химический ожог, обусловленный компонентами, входящими в его состав, поэтому через 24 часа после проведения конъюнктивальной пробы согласно протокола исследования было принято решение о проведении лечения кератоконъюнктивита у кроликов, включающего санацию пораженных глаз физиологическим раствором с последующим применением лекарственных средств: глазные капли флоксал 5-6 раз в день по 1 капле в больной глаз, раствор ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) по 1 капле в больной глаз 5–6 раз в день. Интервал между применениями препаратов составлял 5 минут.

Проводимая терапия оказала позитивное действие на процессы заживления пораженных глаз кроликов. Так, на 3 день лечения у животных все еще отмечалась выраженная гиперемия конъюнктивы, однако слезоточивость и помутнение роговицы отсутствовали (Рисунок 8). К 6 дню лечения роговица стала прозрачной, отек и гиперемия конъюнктивы и век уменьшились, болезненность исчезла, веки стали полностью раскрываться, содружественная реакция зрачков, роговичный и зрачковые рефлексы пришли в норму, просвет глазной щели стал симметричным относительно противоположного здорового глаза (Рисунок 9). Из симптомов заболевания еще присутствовала небольшая отечность и нависание конъюнктивы верхнего века.

На 12 день терапии состояние пораженных глаз пришло в норму, целостность роговицы восстановилась, слизистая оболочка приобрела бледнорозовый цвет, истечения и отечность отсутствовали (рисунок 10).

Рисунок 8 – Состояние глаза кролика на 3 день проведения терапии

Рисунок 9 – Состояние глаза кролика на 6 день проведения терапии

Рисунок 10 – Состояние глаза кролика на 12 день терапии

Заключение.    На основании результатов исследований установлено, что при     разрешающем     эпикутанном сенсибилизирующем          накожном тестировании образец препарата ДОН-1 не обладает    местным    раздражающим действием, проявляемым аллергическим контактным дерматитом у животных. Тогда как оценка среднегрупповых показателей теста конъюнктивальной пробы выявила выраженную потенциальную аллергенную активность    препарата,    усиленную токсическим действием входящих в него компонентов, выражаемую стабильными деструктивными повреждениями на слизистые оболочки и конъюнктиву глаза животных.

Резюме

В статье приведены результаты оценки аллергизирующих свойств препарата ДОН-1 на примере экспресс-сенсибилизации кожных покровов морских свинок и выявления его раздражающего действия на слизистые оболочки глаза кроликов. Установлено, что при разрешающем эпикутанном сенсибилизирующем накожном тестировании образец препарата ДОН-1 не обладает местным раздражающим действием, тогда как оценка показателей теста конъюнктивальной пробы установила выраженную потенциальную аллергенную активность препарата, усиленную токсическим действием входящих в него компонентов.