Оценка апоптоза лимфоцитов крови, пролиферации и апоптоза клеток яичника у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием

Введение. Апоптоз или программированная гибель клетки в многоклеточном организме регистрируется в условиях нормы и при патологии. В физиологических условиях процессы апоптоза лежат в основе обеспечения генетического гомеостаза клеток организма, уничтожения генетически уклоняющихся в своем развитии мутантных клеток. Fas-зависимый апоптоз участвует также в завершении иммунного ответа посредством делеции активированных зрелых Т-лимфоцитов, кроме того, он также важен для предупреждения развития воспаления в «иммунопривилегированных» тканях: глазах, мозге, гонадах и т.д., где экспрессия FasL очень высока [1]. В патологии важной биологической функцией апоптоза является уничтожение клеток, инфицированных вирусом или другими внутриклеточными патогенами [1-4]. Мембранными рецепторами готовности клеток к апоптозу являются Fas (CD95, АРО-1), TNF-R1 (tumor necrosis factor receptor 1) и соответствующие им лиганды (Fas-лиганд и TNF-a) [5]. Fas-рецепторы (Fas-R) присутствуют на множестве клеток, в то время как FasL, в основном, расположены на Т-лимфоцитах. При развитии рецептор-зависимого апоптоза происходит связывание рецептора готовности к апоптозу и лиганда, например, Fas-R и FasL, далее активируется внутриклеточный домен смерти (Fas-associated death domain), что приводит к активации каскада каспаз и, в конечном счёте, к гибели клетки-мишени [1, 5]. Единственной функ цией каспаз является участие в апоптозе [6]. При этом, каспаза 8 активирует каспазу второго эшелона (эффекторную каспазу 3), после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым. К наиболее важным участникам этого процесса относятся не только Fas, каспазы, но и другие регуляторные белки, в т.ч. растворимые формы sFas и sFasL, проапоптогенный белок р53 и др. [7, 8, 9].

Причиной устойчивости различных типов клеток к Fas-зависимому апоптозу может быть повышенная продукция растворимых рецепторов (sFas, sFasL), которые блокируют и предотвращают клеточно-клеточные взаимодействия через соответствующие мембранные рецепторы. Согласование процессов пролиферации и апоптоза клеток каждого органа и системы лежит в основе постоянства клеточного состава тканей. В связи с этим до сих пор мало изученные процессы апоптоза лимфоцитов, а также пролиферации и апоптоза клеток яичников при трубно-перитонеальном бесплодии, развивающемся на фоне генитальной герпетической инфекции с локализацией вируса в яичниках и без герпетической инфекции, представляют интерес для анализа патогенеза данной патологии.

Цель исследования: оценить апоптоз лимфоцитов крови и пролиферативно-апоптотические маркеры в клетках яичника при трубно-перитонеальном бесплодии (ТПБ).

Материал и методы исследования. Проведено обследование 29 пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием. Первую группу составили 16 женщин, у которых установлена атипичная форма генитальной герпетической инфекции с верификацией ВПГ 1,2 в яичниках. Вторую -13 женщин с ТПБ, у которых герпетические вирусы в половой системе женщин ПЦР методом не были обнаружены. В третью группу (контрольную) включены 14 здоровых женщин репродуктивного возраста.

Критериями включения в первую группу были: ■ репродуктивный возраст;

• ■    трубно-перитонеальное бесплодие;

• ■    наличие ВПГ 1,2 в яичниках, верифицированное с помощью ПЦР;

• ■    отсутствие других инфекций, передающихся половым путем.

Критериями включения во вторую группу были:

• ■    репродуктивный возраст;

• ■    трубно-перитонеальное бесплодие;

• ■    отсутствие инфекций, передающихся половым путем.

Методы обследования включали: сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотры пациенток, общее клинико-лабораторное обследование, проведение инструментального (УЗИ, лапароскопия), микробиологического, иммунологического и иммуногистохимического исследований. Микробиологическое исследование проводилось путем обследования пациенток методом ПЦР на инфекции, передающиеся половым путём, включая вирус простого герпеса (ВПГ 1,2) в биоптатах яичников.

Иммунологическое исследование включало определение на лимфоцитах крови маркеров готовности к апоптозу (CD95+), морфологическую оценку апоптоза, активность каспазы 3 и 8, уровень sFas в крови и перитонеальной жидкости.

Лимфоциты крови выделяли методом градиентного центрифугирования по Boyum А. (1968). Число лимфоцитов крови, экспрессирующих CD95 рецептор, определяли с помощью непрямого им-мунофлюоресцентного метода на основе моноклональных антител производства НПО «Препарат» (Новосибирск). Морфологическую оценку фрагментации ядра лимфоцитов проводили с помощью окрашивания Hoechst 33342 (Boehringer Mannheim), который накапливается в ядрах окрашиваемых клеток. Учет осуществляли на микроскопе ЛЮМАМ-И1 при длине волны возбуждения ЗбОнм и эмиссии 470 нм. Подсчитывали процент клеток с морфологическими признаками апоптоза (Vermes I. et al., 2000).

Оценку активности каспазы 3 и 8 проводили флюориметрическим методом (Nicholson et al., 1995) со стандартной тест-системой ApoTarget Caspase-3, 8 Protease Assay Kit (KHZ0051, BIOSOURCE, Бельгия). В качестве флюорогенного субстрата для оценки активности эффекторной каспазы 3 использовали Ac-DEVD-AFC (Asp-Glu-

Val-Asp). В качестве субстрата для каспазы 8 применяли Ac-IEHD-AFC. Измерение флюоресценции после инкубации проводили на Versa Fluor (# 1702402) фирмы BioRad при фильтре возбуждения 400 + 10 нм, фильтре эмиссии 505 + 5 нм. Расчет ферментативной активности в условных единицах флюоресценции субстрата проводили по формуле: AS = [S(tj) - B(tj)] - [S(to) - B(to) ] / At, где S - сигнал измеряемого образца на момент времени t; В - сигнал реагент-бланка на момент времени t; h - время завершения измерения; to - время начала измерения; At = (h - to). Растворимый Fas[sFas] определяли в сыворотке крови и перитонеальной жидкости пациенток иммуноферментным методом с помощью тест-системы: Austria. Beuder Med Systems Gimble numan sAPO l|Fas BMS 245 LOT 335 35230, регистрация результатов - на «Multiscan Plus» [Labsystem] при длине волны 450 нм. Определение экспрессии белков р53, Ki67 и PCNA в гистологических срезах яичника проводили иммуногистохимическим методом с применением тест-систем «Нафтол AS-MX-фосфат Free acid (№4875 Sigma)» (USA); «RTU-Ki-67-MMl», «NCL-L-PCNA» (Великобритания) и системы мечения Immu-mark (ICN) на парафиновых гистологических срезах.

Полученные материалы исследования статистически обработаны с помощью программы «Statistica 6» с использованием параметрических и непараметрических методов. Результаты исследования в таблицах представлены в виде средней арифметической (М) и ошибки средней (т), а также в виде медианы (Me) и квартильного размаха (Q25-Q75). Минимальный уровень достоверности при р < 0,05.

Результаты исследования. Для анализа процессов программированной клеточной гибели лимфоцитов крови у женщин с ТПБ на первом этапе данного исследования было определено общее число лимфоцитов крови и количество лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы готовности к апоптозу, число лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза в виде фрагментации ядра клеток, уровень растворимого sFas рецептора в крови. Данные, полученные у пациенток с ТПБ в сочетании с верифицированной с помощью ПЦР генитальной герпетической инфекцией, локализованной в яичниках, а также у пациенток с ТПБ без этой инфекции и у здоровых женщин приведены в табл. 1.

Из табл. 1 следует, что в группе пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, сочетающимся с герпетической инфекцией, локализованной в тканях яичника, общее число лимфоцитов, а также количество лимфоцитов с готовностью к апоптозу (CD95+) оказалось существенно выше в сопоставлении с больными, имеющими данную форму бесплодия без ассоциации с генитальной герпетической инфекцией, а также с группой здоровых женщин репродуктивного возраста. Рост общей численности лимфоцитов в крови следует

Таблица 1

Анализ маркёров апоптоза лимфоцитов крови у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием

Показатели	1 группа (больные с ТПБ и генитальной герпетической инфекцией) п = 16		2 группа (больные с ТПБ) п = 9		3 группа контрольная (здоровые женщины) п = 14		р
	Me	QL-QU	Me	QL-QU	Me	QL-QU
Лейкоциты	5,6	4,8-6,0	4,8	4,3-5,8	4,65	4,2-5,1	0,09
Лимфоциты	29,5	26,0-33,0	28,0	25,0-30,0	26	23-27	0,031_з
CD95 %	12%	12-15 %	12%	10-12 %	10%	8-12 %
CD95 (абс.)	0,19	0,17-0,23	0,15	0,2-0,21	0,14	0,1-0,21	0,04i_2, 0,041_з
Клетки с фрагментацией ядра(%)	2,5%	1,5-5 %	3 %	2-7%	3%	3-4%
Клетки с фрагментацией ядра (абс.)	0,03	0,01-0,085	0,03	0,02-0,07	0,045	0,02-0,07	0,08
ИРА	15,8		20		32,14		0,2
sFas (пг/мл)	52,72	49,14-56,94	74,78	50,57-93,62	—	—	0,04

Примечание. Достоверность различий но критерию Вальда-Вольфовица.

рассматривать как адекватную реакцию иммунной системы на герпетическую инфекцию, связанную с формированием клеточного иммунного ответа. Параллельно увеличению общего количества лимфоцитов в крови происходит рост абсолютного числа лимфоцитов с готовностью к Fas-зависимому апоптозу (CD95 клеток). Однако рост числа лимфоцитов с готовностью к апоптозу у пациенток 1 группы не сопровождался увеличением количества лимфоцитов с признаками фрагментации ядра, свидетельствующими о необратимости процесса апоптоза. Индекс реализации апоптоза, т.е. процент лимфоцитов с завершенным процессом программированной клеточной смерти от общего числа лимфоцитов с готовностью к апоптозу (ИРА) оказался минимальным у женщин с генитальной герпетической инфекцией, хотя разница между группами статистически не достоверна.

Дальнейший анализ изменений механизмов апоптоза лимфоцитов был проведен на основе определения растворимого (sFas) рецептора в сыворотке крови пациенток, который оказался существенно ниже у пациенток с ТПБ, ассоциированным с генитальной герпетической инфекцией, чем у пациенток с аналогичной патологией без герпетической инфекции.

Далее нами было проведено параллельное определение sFas рецептора в сыворотке крови и перитонеальной жидкости у пациенток 1 группы с наличием вируса герпеса в яичниках (табл. 2).

В перитонеальной жидкости у женщин с ТПБ, сочетающимся с наличием ВПГ 1,2 в яичниках, уровень sFas рецептора был приблизительно вдвое выше, чем в сыворотке крови тех же пациенток. Можно предполагать, что наличие вируса в тканях яичника способствует локальному увеличению в серозной жидкости брюшной полости уровня sFas, что может быть связано со сбрасыванием рецептора с мембран инфицированных клеток, либо с усилением продукции растворимой формы рецептора инфицированными клетками по механизму альтернативного сплайсинга.

Учитывая, что растворимая форма рецептора (sFas) может блокировать FasL и тем самым препятствовать процессу клеточно-клеточного взаимодействия через соответствующие мембранные рецепторы (Fas-FasL), можно предполагать, что лимфоциты, находящиеся в перитонеальной жид-

Таблица 2

Уровень sFas в сыворотке крови и в перитонеальной жидкости у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, сочетающимся с генитальной герпетической инфекцией

Показатели	Перитонеальная жидкость п = 12		Сыворотка крови п= 16		Р
	Me	QL-QU	Me	QL-QU	W-W	KS
sFas (пг/мл)	112,3	106,4-124,6	52,725	49,14-56,94	0,01	0,01

Примечание. Достоверность различий по критерию Вальда-Вольфовица, Колмогорова-Смирнова.

кости в условиях высокого содержания sFas, в меньшей степени способны к инициации программированной клеточной гибели, чем лимфоциты крови. Можно далее предполагать, что эти лимфоциты и другие клетки, находящиеся в верхних отделах половой системы, в результате избытка sFas в серозной жидкости в меньшей степени способны реализовать свою готовность к апоптозу, что определяет условия для персистирования ВПГ1,2 в альным бесплодием при обнаружении ВПГ1,2 в биоптатах яичника. Напротив, уровень эффекторной каспазы 3 в лимфоцитах крови оказался существенно выше у женщин с ТПБ, имеющих генитальную герпетическую инфекцию, в сравнении с группой здоровых женщин. Эти показатели отражают изменение баланса активности каспазы 3 и каспазы 8 у больных в сравнении со здоровыми женщинами.

Таблица 3

Активность каспазы 3 и каспазы 8 в лимфоцитах крови пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием

Показатели	1 группа (больные с генитальной герпетической инфекцией и ТПБ) п = 16			3 группа (здоровые женщины) п= 14			Р
	Me	QL-QU	М ± m	Me	QL-QU	M + m
S casp 3	0	0-2,6	1,53 ± 0,5	0	0-0,015	0,0075 ± 0,007	0,04
S casp 8	0	0-0	0,67 ± 0,4	0,73	0,21-1,165	0,7 ± 0,28	0,01

Примечание. Достоверность различий по критерию Вальда-Вольфовица.

клетках, омываемых серозной жидкостью перито-неума, в том числе в клетках яичников, в ткани которых нами обнаруживался с помощью ПЦР материал вирусов у женщин с ТПБ и генитальной герпетической инфекцией. Это предположение подтверждается литературными данными. Множественные исследования in vitro и in vivo показали, что апоптоз хорошо представлен в норме в клетках гранулезы яичников. У женщин клетки гранулезы антральных фолликулов экспрессируют Fas в ранней стадии атрезии [10]. Экспрессия Fas может быть изменена различными факторами роста, гормонами, цитокинами [11].

Следующим этапом работы стала оценка активности каспазы 8 и эффекторной каспазы 3 в лимфоцитах крови женщин с ТПБ, ассоциированным с генитальной герпетической инфекцией, в сопоставлении со здоровыми женщинами (табл. 3). В данной таблице средние значения активности каспаз даны в виде медианы и квартильного размаха. Однако более чем у половины пациенток уровень активности каспазы равен 0, поэтому при пользовании универсальной средней (медианой), которая является серединой ряда при расположении значений переменной в порядке её убывания или нарастания, сама медиана в сравниваемых выборках чаще всего оказывалась равной 0, хотя с помощью непараметрических критериев выявляются достоверные различия между сравниваемыми группами. Чтобы более наглядно представить различия в средних величинах, мы выражали активность каспаз не только в виде медианы, но и в виде средней арифметической и ее ошибки (М ± т), что представлено в той же табл. 3.

Из табл. 3 следует, что у здоровых женщин уровень активности каспазы 8 оказался существенно выше, чем у пациенток с трубно-перитоне-

Был проведен корреляционный анализ между активностью каспаз лимфоцитов и уровнями растворимых Fas рецепторов в крови женщин с ТПБ. Эти данные приведены в табл. 4.

Как видно из табл. 4, выявлена положительная достоверная связь между активностью каспазы 3 и каспазы 8, что подтверждает известную закономерность о последовательной и зависимой активации эффекторной каспазы 3 после активации каспазы 8. Установлена также отрицательная связь между активностью каспазы 8 и уровнем раство-

Таблица4

Коэффициент корреляции [Kendall] между активностью каспаз лимфоцитов и уровнем sFas в сыворотке крови пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием

Показатели R Р casp3-casp8 0,51 0,01 casp8-sFas -0,45 0,03 римого Fas рецептора в крови, свидетельствующая, что снижение уровня sFas закономерно сопровождается ростом активности каспазы 8. Механизм этой связи может быть следующим: при снижении уровня sFas создаются условия для клеточно-клеточных взаимодействий (sFas - FasL), что и инициирует через домен смерти превращение неактивной каспазы 8 (прокаспазы) в активную форму, т.е. сопровождается ростом активности данной каспазы.

В соответствии с целью исследования проведен иммуногистохимический анализ процессов пролиферации и апоптоза клеток в тканях яичника у женщин с ТПБ в сочетании с генитальной герпетической инфекцией. Оценивалось количество клеток, экспрессирующих маркеры пролиферативной активности (PCNA и Ki67), характерные для S-фазы клеточного цикла, и количество клеток, экспрессирующих проапоптогенный регуляторный белок (р53). При оценке этих показателей учитывалась фаза менструального цикла. Результаты, полученные в фазу пролиферации, достоверных различий по уровню экспрессии маркеров пролиферации и р53 в клетках яичника не выявили.

В табл. 5 приведены результаты исследования биоптатов яичников, взятых в секреторную фазу менструального цикла. Как следует из табл. 5, в секреторной фазе менструального цикла в яичниках на фоне локальной герпетической инфекции достоверно повышается количество клеток, экс чали механизмы апоптоза в иммунокомпетеных клетках при этой инфекции. Оказалось, что при трубно-перитонеальным бесплодии, сочетающимся с генитальной герпетической инфекцией, локализованной в тканях яичников, существенно повышается число лимфоцитов в крови с готовностью к апоптозу, но при этом не происходит увеличения количества лимфоцитов с признаками реализованной программированной клеточной гибели. По данным литературы, вирусные гены кодируют белки, которые могут защищать клетки от апоптоза, тем самым способствуют выживанию инфицированных клеток и персистенции в них внутриклеточных патогенов [14]. Результаты ис

Таблица 5

Маркёры клеточной пролиферации и регуляторных белков апоптоза у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием (ТПБ) на фоне атипичной генитальной герпетической инфекции в секреторной фазе менструального цикла

Показатели (количество клеток на 1 мм2) (секреторная фаза м/цикла)	1 группа генитальная герпетическая инфекция и ТПБ (п = 16)		2 группа ТПБ (п = 13)		Р
	Me	QL-QU	Me	QL-QU
PCNA	713,9	475,068-1053,976	521,796	490,644-667,172
Ki67	809,952	776,204-949,132	760,628	633,424-771,012	0,04
Р53	828,124	584,1-934,176	703,516	591,888-838,508

Примечание. Достоверность различий по критерию Манна-Уитни.

прессирующих маркёр пролиферации Ki67, что свидетельствует об усилении пролиферативных процессов у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. Это может создавать оптимальные условия для инфицирования пролиферирующих клеток яичника вирусом и его персистенции в них. Из таблицы видно также, что увеличение пролиферирующих клеток в яичнике не сопровождается ростом клеток, экспрессирующих белок р53, который при накоплении в клетке способствует развитию апоптоза в качестве ответа на повреждение ДНК [12]. Торможение инициации апоптотических процессов в клетках, омываемых перитонеальной жидкостью, может осуществляться за счет выраженного роста в серозной жидкости sFas рецептора, вдвое превышающего уровни рецептора в крови, который может блокировать мембранные клеточно-клеточные взаимодействия, инициирующие Fas-зависимый апоптоз.

Обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что при трубно-перитонеальном бесплодии, ассоциированном с хронической генитальной герпетической инфекцией, локализованной в яичниках, происходит достоверное повышение общего количества лимфоцитов крови, что характерно для любой хронической инфекции, которая инициирует активацию специфических иммунных клеток и их клональную экспансию. Исходя из литературных данных о возможности персистенции ВПП,2 в лимфоцитах [13], мы изу следования показали, что в крови пациенток с ТПБ, ассоциированным с генитальной герпетической инфекцией уровень эффекторной каспазы 3 в лимфоцитах крови оказался существенно выше, а уровень sFas рецептора в сыворотке крови ниже, чем у женщин без этой инфекции. В тоже время, в перитонеальной жидкости у женщин с ТПБ, сочетающимся с наличием ВПГ 1,2 в яичниках, уровень sFas рецептора был вдвое выше, чем в сыворотке крови тех же пациенток. Следовательно, наиболее выраженные изменения иммунного гомеостаза, влияющие на клеточный апоптоз, установлены у женщин с ТПБ, сочетающимся с генитальной герпетической инфекцией, локализованной в яичниках, непосредственно в перитонеальной жидкости.

Мы провели иммуногистохимическое исследование маркёров пролиферации и апоптоза в клетках яичника. Из литературных данных известно, что большинство фолликулов в яичнике подвергается атрезии посредством Fas-индуцирован-ного апоптоза, который происходит в основном в клетках гранулезы [14]. У женщин с ТПБ в секреторной фазе менструального цикла в яичниках на фоне локальной генитальной герпетической инфекции достоверно повышается количество клеток, экспрессирующих маркёр пролиферации Ki67 и не меняется число клеток яичника, экспрессирующих проапоптогенный белок р53.

Наши данные о влиянии генитальной герпетической инфекции на процессы апоптоза при ТПБ соответствуют литературным материалам о процессах торможения апоптоза клеток-мишеней, в которых персистируют вирусы, о способности самих вирусов вырабатывать вещества, похожие на естественные ингибиторы процесса клеточной гибели [15].