Оценка белкового метаболизма в гепатоцитах нутрий в постнатальном онтогенезе

Введение. Печень является сложным многофункциональным экзо- и эндокринным органом. Эндокринные функции включают секрецию гормонов, таких как инсулиноподобные факторы роста, ангиотензиноген и тромбопоэтин, в то время как основная экзокринная функция – жел-чевыделение. Печень необходима для хранения гликогена, детоксикации лекарств, контроля метаболизма, регуляции синтеза и транспорта холестерина, метаболизма мочевины и секреции широкого спектра белков плазмы, включая альбумин и паполипопротеины [1]. Кроме того, печень обладает значительной врожденной регенеративной способностью за счет деления гепатоцитов и пролиферации клеток-предшественников. Однако при хроническом воспалении эти резервы в конечном итоге иссекают [2, 3].

Гепатоциты, основные паренхиматозные клетки печени, играют ключевую роль в метаболизме, детоксикации и синтезе белка. Гепатоциты также активируют врожденный иммунитет против микроорганизмов, выделяя гуморальные факторы врожденного иммунитета [4].

Известно, что белки – центральное звено всех биохимических реакций в живых организмах. Механизмы синтеза и транспорта белка в животных клетках имеют комплекс видовых, половых и возрастных различий [5–7], что, в свою очередь, диктует необходимость изучения особенностей белкового метаболизма в клетках органов и тканей с большим охватом представителей животного мира с учетом половозрастной принадлежности.

Области ядрышковых организаторов осуществляют синтез 18S, 5.8S и 28S классов рибосомальной РНК, непосредственно принимающих участие в сборке рибосом, в которых, в свою очередь, происходит синтез белка [8]. Морфометрические параметры областей ядрышковых организаторов позволяют дать оценку белковосинтетической функции клеток [9].

Нутрии, как объект звероводства и как представители дикой природы, являются крайне малоизученными, о чем говорит низкая публикационная активность в области биологии и ветеринарии этого вида животных. Однако широкое распространение по всему миру, а также близкое соседство с человеком делает необходимым контролировать здоровье и популяцию нутрий посредством углубленного изучения биологических процессов, происходящих в их организме.

Цель работы . Определить параметры активности областей ядрышковых организаторов и суммарного содержания белка в гепатоцитах самок и самцов нутрий в постнатальном онтогенезе.

Материал и методы. Исследования проведены c 2014 по 2020 г. На кафедре физиологии, хирургии и акушерства, в научно-диагностическом и лечебном ветеринарном центре ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет» и частных фермерских хозяйствах Краснодарского края.

Объектом исследования служили 30 клинически здоровых самок и самцов нутрий (по 3 самки и 3 самца в каждой возрастной группе) стандартного окраса клеточного содержания в возрасте 1 сутки (новорожденность), 2 месяца (окончание молочного вскармливания), 4,5 месяца (половое созревание), 7,5 месяцев (физиологическое созревание) и 12 месяцев (зрелые особи).

Кормление нутрий осуществлялось комбинированным способом согласно рекомендациям В.Ф. Кладовщикова (1998) [10].

Для выполнения исследований проводили эвтаназию нутрий в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. У самцов и самок каждой возрастной группы проводили отбор печени для гистохимических исследований. Материал фиксировали в 10%-м водном растворе нейтрального формалина, проводили через спирты возрастающей крепости и ксилол, а затем заливали в гистологическую среду «Гистомикс». После заливки кусочки органов фиксировали на стандартные гистологические кассеты и приготавливали гистосрезы толщиной 5 мкм.

Для выявления областей ядрышковых организаторов (AgNOR) в ядрах гепатоцитов гистосрезы печени окрашивали нитратом серебра по оригинальной методике, предложенной W.M. Howell, D.A. Black (1980) [11]. Реакция на сум- марные белки проводилась с использованием водного сулемового раствора бромфенолового синего [12].

С каждого препарата печени выполняли по 10 цифровых снимков случайно выбранных полей зрения при увеличении 400 (для препаратов с реакцией с водным сулемовым раствором бромфенолового синего) и 1000 (для препаратов, окрашенных нитратом серебра). В каждом снимке с реакцией с водным сулемовым раствором бромфенолового синего выполняли по 10 измерений оптической плотности гепатоцитов. В каждом снимке препаратов, окрашенных нитратом серебра, выполняли 10 подсчетов количества AgNOR и по 10 измерений суммарной площади AgNOR и ядра гепатоцитов, долю суммарной площади AgNOR от общей площади ядра гепатоцитов рассчитывали математически.

Определение оптической плотности и морфометрические исследования проводили с использованием программы Видео-Тест Морфология 5.1 для Windows.

Числовые данные обрабатывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Ньюмена – Кейлса в программе Primer of Biostatistics 4.03 для Windows, где n – объем выборки, M – среднее арифметическое выборки, m – стандартная ошибка среднего. Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. AgNOR в ядрах гепатоцитов нутрий имеют округлую или близкую к ней форму (рис. 1), а их количество находится в пределах от 1 до 2, при этом 2 зоны AgNOR встречаются намного реже.

Числовые данные параметров активности AgNOR в ядрах гепатоцитов нутрий разного пола и возраста представлены в таблице 1.

Наибольшее количество AgNOR в ядрах гепатоцитов нутрий зарегистрировано в возрасте 4,5 месяцев, при этом у самцов значение этого показателя имеет достоверные различия с предыдущим возрастом (больше на 4,85 %), а у самок – с последующей возрастной группой (больше на 6,49 %). Между остальными возрастными группами, а также между самками и самцами одного возраста достоверных различий по количеству ОЯОР не выявлено.

Рис. 1. AgNOR в ядрах гепатоцитов самца нутрии в возрасте 12 месяцев (импрегнация серебром, ×1000)

Таблица 1

Параметры активности AgNOR в ядрах гепатоцитов нутрий разных половозрастных групп

Пол	Возраст
	1 сутки М±m	2 месяца М±m	4,5 месяца М±m	7,5 месяца М±m	12 месяцев М±m
Количество AgNOR
Самка (n=300)	1,057±0,013	1,047±0,012	1,083±0,016	1,017±0,008*	1,033±0,010
Самец (n=300)	1,043±0,012	1,030±0,010	1,080±0,016*	1,033±0,010	1,010±0,006
Суммарная площадь AgNOR, мкм2
Самка (n=300)	3,015±0,035	3,177±0,033*#	2,529±0,026*#	2,761±0,036*#	3,034±0,031*
Самец (n=300)	2,944±0,028	2,979±0,026	2,441±0,024*	2,595±0,027*	3,108±0,027*
Доля суммарной площади AgNOR от общей площади ядра
Самка (n=300)	0,100±0,001	0,101±0,001#	0,090±0,001*#	0,086±0,001*#	0,094±0,001*
Самец (n=300)	0,091±0,001	0,106±0,001*	0,087±0,001*	0,092±0,001*	0,095±0,001*

Здесь и далее: * – статистическая значимость различий с более ранней возрастной группой; # – у самок по сравнению с самцами одной возрастной группы.

При анализе суммарной площади AgNOR в ядрах гепатоцитов нутрий установлено, что с первого дня и до двухмесячного возраста значение этого показателя достоверно возрастает только у самцов нутрий на 5,37 %. С двух и до 4,5-месячного возраста суммарная площадь AgNOR в ядрах гепатоцитов у самок и самцов нутрий достоверно уменьшается на 25,62 и 22,04 % соответственно. В период с 4,5 и до 7,5 месяцев жизни значение исследуемого показателя достоверно возрастает у самок нутрий на

9,17 %, а у самцов – на 6,31 %. В возрасте двенадцати месяцев суммарная площадь AgNOR в ядрах гепатоцитов у самок и самцов нутрий продолжает увеличиваться на 9,88 и 19,74 % соответственно, по сравнению с предыдущим возрастом.

При сравнении суммарной площадь AgNOR в ядрах гепатоцитов нутрий между самками и самцами одного возраста достоверные различия установлены только в возрасте 2, 4,5 и 7,5 месяцев, при этом у самок значение данного показателя было больше, чем у самцов, на 6,65 %; 3,61 и 6,40 % соответственно.

Доля суммарной площади AgNOR от общей площади ядра гепатоцитов нутрий с первого дня и до двух месяцев жизни достоверно увеличивается только у самцов – на 16,48 %. В период с 2 и до 4,5 месяцев жизни значение этого показателя достоверно уменьшается у самок нутрий на 12,22 %, у самцов – на 21,84 %. С 4,5 и до 7,5месячного возраста доля суммарной площади AgNOR от общей площади ядра гепатоцитов у самок нутрий достоверно уменьшается на 4,65 %, а у самцов, напротив, увеличивается на 5,75 %. В возрасте 12 месяцев значение данного показателя как у самок, так и у самцов нутрий достоверно больше на 9,30 и 3,26 % соответственно, чем у особей 7,5-месячного возраста.

При анализе оптической плотности суммарного белка в гепатоцитах нутрий установлено (рис. 2, табл. 2), что с первого дня и до двух месяцев жизни значение данного показателя достоверно уменьшается – у самок на 19,48 %, а у самцов – на 9,33 %. С 2 до 4,5-месячного возраста оптическая плотность суммарного белка в гепатоцитах нутрий достоверно возрастает – у самок на 11,04 %, а у самцов – на 14,66 %. С 4,5 и до 7,5 месяцев жизни значение этого показателя достоверно возрастает только у самцов нутрий – на 9,88 %, а у самок остается неизменным. В возрасте 12 месяцев оптическая плотность суммарного белка в гепатоцитах у самок нутрий достоверно возрастает на 11,70 %, а у самцов, напротив, уменьшается на 15,95 % по сравнению с особями предыдущей возрастной группы.

Рис. 2. Гепатоциты самки нутрии в возрасте 4,5 месяцев (реакция на суммарные белки с водным сулемовым раствором бромфенолового синего, ×400)

Таблица 2

Оптическая плотность суммарного белка в гепатоцитах нутрий разных половозрастных групп, у.е.

Пол	Возраст
	1 сутки М±m	2 месяца М±m	4,5 месяца М±m	7,5 месяцев М±m	12 месяцев М±m
Самка (n=300)	0,184±0,002#	0,154±0,001*	0,171±0,001*	0,171±0,001#	0,191±0,002*#
Самец (n=300)	0,164±0,001	0,150±0,001*	0,172±0,001*	0,189±0,001*	0,163±0,001*

Между самками и самцами нутрий одного возраста достоверные различия оптической плотности суммарного белка выявлены только в возрасте одних суток, 7,5 месяцев и 12 месяцев. При этом в односуточном и двенадцатимесячном возрасте значение данного показателя достоверно выше у самок нутрий на 12,20 и 17,18 % соответственно, а в 7,5-месячном возрасте оптическая плотность суммарного белка в гепатоцитах нутрий достоверно выше у самцов на 10,53 %.

Из анализа полученных данных становится очевидно, что однодневный возраст нутрий характеризуется достаточно высокими значениями исследуемых показателей в гепатоцитах, что может свидетельствовать о достаточно активном клеточном метаболизме, вероятно, связанном с защитно-приспособительными реакциями в их организме после рождения.

Однако при достижении двухмесячного возраста оптическая плотность суммарного белка гепатоцитов демонстрирует значительное снижение по сравнению с однодневными особями, при этом суммарная площадь AgNOR и доля суммарной площади AgNOR от общей площади ядра, напротив, возрастают. Объяснением данной закономерности может быть формирование дефицита пластических компонентов, в частности белков, в гепатоцитах двухмесячных нутрий на фоне повышенной белково-синтетической функции гепатоцитов, что, на наш взгляд, связано с повышенной потребностью организма в белках и параллельным прекращением молочного вскармливания.

В 4,5-месячном возрасте у нутрий вновь регистрируется повышение оптической плотности суммарного белка и количества AgNOR, при этом суммарная площадь AgNOR и доли суммарной площади AgNOR от общей площади ядра значительно понижаются. Выявленная особенность может свидетельствовать об относительном уменьшении белково-синтетического потенциала гепатоцитов, связанных с изменениями в организме во время полового созревания.

7,5-месячный возраст нутрий сопровождается максимальным значением суммарного белка у самцов и минимальными количеством AgNOR и доли суммарной площади AgNOR от общей площади ядра у самок нутрий. Суммарная площадь AgNOR в данном возрасте как у самок, так и самцов начинает возрастать.

В 12-месячном возрасте наблюдается максимальное увеличение оптической плотности суммарного белка у самок и максимальная суммарная площадь AgNOR у самцов нутрий.

Изменения параметров AgNOR в ядрах и оптической плотности суммарного белка гепатоцитов у особей разного пола и одного возраста на поздних этапах постнатального онтогенеза (7,5 и 12 месяцев) наглядно демонстрируют появление разной возрастной динамики этих показателей. При этом на ранних этапах постнатального онтогенеза нутрий (одни сутки, два и четыре с половиной месяца) значения исследуемых показателей, несмотря на ряд достоверных половых различий, сохраняют на одинаковую возрастную динамику. Данная закономерность может быть доказательством того, что после полового созревания белковый метаболизм в гепатоцитах у нутрий имеет более существенные различия в своей скорости и направленности.

Выводы. AgNOR в ядрах гепатоцитов нутрий имеют округлую или близкую к ней форму, а их количество находится в пределах от 1 до 2, при этом 2 зоны AgNOR встречаются намного реже.

Анализ параметров AgNOR показал, что максимальное количество AgNOR в ядрах гепатоцитов выявлено в возрасте 4,5 месяцев, при этом суммарная площадь AgNOR в этом возрасте, напротив, имела минимальные значения. Минимальное количество AgNOR в ядрах гепатоцитов у самок нутрий регистрируется в возрасте 7,5 месяцев, а у самцов – в возрасте 12 месяцев, при этом максимальная суммарная площадь AgNOR у самок нутрий была в возрасте 2 месяца, а у самцов в 12 месяцев. Доля суммарной площади AgNOR от общей площади ядра гепатоцитов у самок и самцов имела максимальные значения в двухмесячном возрасте, а максимальные у самок в 7,5, у самцов – в 4,5 месяца.

Повышение суммарного белка гепатоцитов у самцов нутрий наблюдается в возрасте 7,5 месяцев, а у самок – в 12 месяцев, при этом наиболее низкие значения этого показателя установлены у особей обоего пола в двухмесячном возрасте.

С первого дня и до 4,5 месяцев жизни у самок и самцов нутрий наблюдается одинаковая возрастная динамика параметров AgNOR и оптической плотности суммарного белка в гепатоцитах, а в 7,5 и 12-месячном возрасте значения данных показателей приобретают разную возрастную динамику.

Ветеринария и зоотехния Литература