Оценка безопасности мяса цыплят-бройлеров на основе микроструктурного анализа

Введение . Исходя из требований технического регламента Евразийского экономического союза (ТР ЕАЭС) «О безопасности мяса птицы и продукции ее переработки» (находится на стадии публичного обсуждения с марта 2017 г.), подтверждение соответствия продукции из мяса птицы требованиям безопасности осуществляется путем принятия заявителем декларации о соответствии на основании собственных доказательств и доказательств, полученных с участием органа по сертификации систем менеджмента, аккредитованной испытательной лаборатории, включенной в Единый реестр органов по сертификации и испытательных лабораторий [1].

Одним из этапов оценки соответствия продукции из мяса птицы требованиям безопасности является проведение испытаний (исследований) образцов продукции из мяса птицы.

Методы испытаний (исследований) и измерений устанавливаются во включенных в перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований безопасности, а также осуществления оценки соответствия продукции.

Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013) [2] и осуществления оценки (подтверждения) соот- ветствия продукции, утвержден Решением Коллегии Евразийской экономической комиссииот 26 мая 2014 года № 81.

К межгосударственным и национальные стандартам, позволяющим проводить идентификацию и устанавливать качество мясной продукции гистологическим методам, относятся: ГОСТ Р 51604-2000 «Мясо и мясопродукты. Идентификация состава гистологическим методом»; ГОСТ Р 52480-2005 «Мясо и мясопродукты. Ускоренный гистологический метод установления состава сырьевых компонентов»; ГОСТ Р 53213-2008 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок»; ГОСТ Р 532222008 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных углеводных добавок»; ГОСТ Р 53853-2010 «Мясо птицы. Методы гистологического и микроскопического анализа»; ГОСТ 31796-2012 «Мясо и мясные продукты. Ускоренный гистологический метод определения структурных компонентов состава»; ГОСТ 31479-2012 «Мясо и мясные продукты. Метод гистологической идентификации состава»; ГОСТ 31467-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям»; ГОСТ 19496-2013 «Мясо и мясные продукты. Метод гистологического исследования».

По данным стандартам возможно исследовать мясо птицы (тушки и части тушек кур, цыплят, цыплят-бройлеров, цесарят, цесарок, перепелов, уток, утят, гусей, гусят, индеек, индюшат) методами гистологического и микроскопического анализа при определении свежести мяса в случае сомнения при оценке его качества.

Метод гистологического анализа основан на определении состояния структурных элементов мышечных тканей на гистологических препаратах, локализации и размножения микрофлоры и качественной оценке степени свежести или порчи мяса птицы на основе наблюдаемых микроструктурных характеристик.

В настоящее время гистологические исследования мяса птицы и продуктов его переработки проводят по ГОСТ 19496-13 «Мясо и мясные продукты. Метод гистологического исследования», который распространяется на мясо всех видов убойных животных и птицы, мясо меха- нической обвалки и дообвалки; мясные и мясосодержащие полуфабрикаты (кусковые, рубленые, фарши, пельмени), в том числе с использованием мяса птицы; продукты из мяса; колбасные изделия, в том числе с использованием мяса птицы; мясные и мясосодержащие консервы, в том числе с использованием мяса птицы, и устанавливает гистологический метод определения свежести и степени созревания мяса, а также структуры и состава мясных продуктов [3].

Гистологический метод основан на определении характеристики микроструктурных показателей мясного сырья и готовых мясных продуктов, идентификации компонентов анализируемых образцов в соответствии с их микроструктурными особенностями, а также установлении соотношения этих компонентов на гистологических препаратах.

Преимуществом микроструктурного метода является выявление незначительных начальных изменений структур тканей, отражающихся на качестве мяса.

Цель исследований . Определение безопасности продуктов убоя птицы на основе микроструктурного анализа.

Материал и методы . Исследования проведены в 2017 году на базе АО «ЕнисейАгроСо-юз» Сухобузимского района Красноярского края, а также в гистологической лаборатории кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии Красноярского государственного аграрного университета.

Объектом исследования являлись цыплята-бройлеры. Пробы мышц и внутренних органов (печень, почки, легкие, сердце, мышечный желудок) отбирали размерами не менее 1см2 из участков, наиболее быстро подвергающихся порче, на всю глубину: мышцы брюшной стенки, мышцы в области шейного зареза, а также мышцы голени и пекторальные мышцы. Места отбора проб протирали 96% этиловым спиртом. Кусочки органов фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина, затем промывали под проточной водой, обезвоживали в спиртах воз- растающей крепости и заливали в парафин (с добавлением 3–5% воска) согласно общепринятым методам [4]. Гистологические срезы изготавливали толщиной 6–10 мкм на санном микротоме с электроприводом и микропроцессорным управлением МЗП-01 «Техном». После депарафинизации и просветления срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха и водным раствором эозина. Микроскопию и морфометрию микроструктурных образований проводили под световыми микроскопами марок МикМед-5, МS-100 (Аustria), при увеличении объектива 10х; 40х; 100х. Микрофотографирование окрашенных препаратов проводили фотоаппаратом Сanon A630. Полученные изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения ВioVision 2005.

Для получения достоверных результатов исследовали не менее двух срезов с каждого из трех кусочков, отобранных от каждого образца. Полученные цифровые данные подвергали статистической обработке с использованием компьютерной программы Statistica.

Термины и обозначения даны в соответствии с Международной ветеринарной анатомической номенклатурой на латинском и русском языках (NominaAnatomicaVeterinaria, 2013).

Результаты исследований и их обсуждение. С точки зрения степени развивающихся аутолитических процессов в мышечной ткани птиц различают следующие микроструктурные характеристики мяса: свежее мясо, свежее, не подлежащее длительному хранению, сомнительной свежести и несвежее (ГОСТ 19496-13). Согласно стандарту, степень (этапы) созревания (аутолиза) мяса определяют по следующим характеристикам: интенсивность автолитического распада мышечных волокон на фрагменты; разволокнение фрагментов на миофибриллы и их распад на саркомеры в виде зернистой массы, заключенной в эндомизий; сохранение восприятия окраски структурами мышечных волокон основных (ядерных) и кислых (цитоплазматических) красителей (табл.).

Микроструктурные характеристики мяса в зависимости от степени созревания

Этап созревания мяса	Микроструктурная характеристика
1-й	В срезах мяса обнаруживаются поперечно-щелевидные нарушения целостности или фрагментация отдельных мышечных волокон при сохранении во фрагментах структуры ядер, поперечной и продольной исчерченности
2-й	В срезах мяса обнаруживаются множественные поперечно-щелевидные нарушения целостности или фрагментация многих мышечных волокон при сохранении во фрагментах структуры ядер, поперечной и продольной исчерченности
3-й	В срезах мяса обнаруживается распад отдельных фрагментов на миофибриллы, а миофибрилл – на саркомеры в виде зернистой массы, местами заключенной в эн-домизий

Анализ микроструктуры мяса цыплят-бройлеров, отобранного в убойном цехе, показал, что для него характерны минимальные структурные изменения и минимальное развитие микрофлоры, что соответствует характеристике свежего мяса. Мышечная ткань в свежем мясе представляет собой совокупность пучков однонаправленных мышечных волокон, представляющих собой многоядерные образования. Отдельное мышечное волокно по всему длин-нику неоднородно, диаметр поперечного сечения варьирует от 52±0,54 до 64±1,8 мкм, что связано с посмертными особенностями сокращения миофибрилл и фрагментарными разрывами сарколеммы. Пучки мышечных волокон разделены прослойками содинительной ткани (рис. 1). Оболочка мышечного волокна представлена собственно цитолеммой и визуально с ней совместимой эластической оболочкой. В саркоплазме, представляющей собой полужидкий золь, содержатся включения жира и гликогена, мембранные органеллы, такие как саркоплазматический ретикулум, митохондрии, а также миофибриллы, состоящие из сократительных белков (миозина, актина, тропонина, тропо- миозина), определяющие пищевую ценность мяса. Ядра мышечных волокон хорошо выражены, саркоплазма равномерно оксифильна, на ее фоне хорошо просматривается поперечнополосатая исчерченность, в прослойках соединительной ткани встречаются единичные скопления кокковой и палочковидной микрофлоры. Многочисленные ядра овально-вытянутой формы располагаются по всему объему саркоплазмы, а не только под сарколеммой, как у млекопитающих. Их состояние (кариопикноз, карио-рексис, кариолизис) может отражать стадию распада мышечного волокна. Поперечнополосатая исчерченность, обусловленная чередованием в мышечном волокне актина и миозина, является важным критерием оценки автолитических процессов. Внутренние органы (желудок, печень сердце) характеризовались минимальными структурными изменениями и минимальным развитием микрофлоры (рис. 2–4). В почках эпителий всех канальцев корковых и мозговых нефронов, сосудистые клубочки почечных телец хорошо выражены. Ядра базо-фильны, базальная исчерченность нефроцитов проксимального отдела выражена. Микрофлора в виде единичных очажков наблюдается в собирательных трубочках мозговой зоны. В легких структуры бронхиальной и альвеолярной части выражены хорошо. Пневмоциты и клетки мерцательного эпителия хорошо дифференцируются. Единичные скопления микрофлоры в просветах бронхиол, мелких и средних бронхов.

А

В

Рис. 1. Мышечная ткань цыпленка-бройлера. Гематоксилин и эозин: А - однонаправленные пучки мышечных волокон, об.10х; Б - прослойки соединительной ткани, разделяющие пучки мышечных волокон, об.40х; В - фрагментарные разрывы сарколеммы (посмертные узлы сокращения), об.100х

Рис. 3. Печень. Гематоксилин и эозин. Об. 40х

Рис. 4. Сердце. Гематоксилин и эозин. Об. 40х

Микроструктура свежего мяса, не подлежащего длительному хранению, характеризовалась локальными структурными изменениями и очаговым развитием микрофлоры.

Микроструктура мяса цыплят-бройлеров сомнительной свежести характеризовалась структурными изменениями в мышечной ткани и внутренних органах. Ядра мышечных волокон находятся в состоянии пикноза, саркоплазма неравномерно оксифильна, поперечнополосатая исчерченность слабо выражена, в прослойках соединительной ткани встречаются многочисленные скопления кокковой и палочковидной микрофлоры (рис. 5). Внутренние органы (желудок, печень) имели характерные деструктивные изменения (рис. 6, 7). Почечный эпителий в состоянии частичной деструкции, ядра бледные размытые, частично лизированы. В зоне распада почечной ткани скопление очагов микрофлоры. В легких отмечается деструкция части пневмоцитов, гладкие миоциты бронхов утрачивают продольную исчерченность. Многочисленные очаги микрофлоры в просветах бронхов и альвеолярной части.

А

Рис. 5. Мышечная ткань цыпленка-бройлера. Гематоксилин и эозин: А - локальная деструкция мышечных волокон; Б - неравномерная оксифилия саркоплазмы

Б

Рис. 7. Печень. Кариопикноз и оксифилия цитоплазмы гепатоцитов. Гематоксилин и эозин.

Об. 40х

Микроструктура несвежего мяса характеризовалась обширными структурными изменениями и многочисленным очаговым развитием микрофлоры. Ядра мышечных волокон в состоянии кариорексиса и кариолизиса, окраска саркоплазмы слабо выражена, неравномерно оки-фильна, отсутствует поперечно-полосатая ис-черченность (рис. 8), встречаются многочисленные скопления кокковой и палочковидной микрофлоры как в прослойках соединительной ткани, так и в саркоплазме мышечных волокон.

А

Б

Рис. 8. Структурные изменения в несвежем мясе цыплят-бройлеров: А - неравномерная оксифилия саркоплазмы, кариолизис и карирексис, продольный срез; Б - неравномерная оксифилия саркоплазмы, кариолизис и карирексис, поперечный срез

Рис. 9. Кариолизис липоцитов

Рис. 10. Распад тканей печени

Поскольку автолитические процессы в мясе птицы протекают быстрее в белых мышцах, чем в красных, необходимо учитывать сроки проведения аналитических исследований. Так, в белых мышцах стадия выраженного созревания наступает к 24 часам после убоя. В красных мышцах автолитические процессы протекают более длительно. Кроме того, необходимо учитывать, что у цыплят-бройлеров автолитические процессы в мясе протекают несколько быстрее, чем у кур-несушек [5, 6]. При этом уровень аутолиза клеток соединительной ткани (фибробластов, гистиоцитов) и мышечных волокон примерно одинаковый. Волокна соединительной ткани (коллагеновые и эластические), напротив, долго сохраняются, что связано с отсутствием в них мембранных структур, через сутки отмечается лишь незначительное набухание фиброзных волокон.

Выводы

• 1.    Преимуществом микроструктурного метода является выявление визуальных изменений клеточных структур мышечной ткани на самых ранних стадиях аутолиза, отражающихся на качестве мяса птицы.

• 2.    Гистологические исследования мяса и субпродуктов цыплят-бройлеров (печень, сердце, мышечный желудок, легкие) позволяют идентифицировать их на видовом, органном, клеточном и внутриклеточном уровне с визуализацией изменений в структуре клеток и тканей.

• 3.    Микроструктурный анализ предполагает подготовку срезов мышечной ткани и внутренних органов толщиной не более 6–8 мкм, их окрашивание основными (ядерными) и кислыми (цитоплазматическими) красителями и исследование под световым микроскопом с увеличением в 100–1000 раз, что позволяет с высокой точностью определять характер изменений в тканях и органах. Кроме того, гистологические препараты подлежат длительному хранению, что важно учитывать при проведении повторных экспертиз при оценке качества и безопасности мяса и субпродуктов птицы.