Оценка биотехнологического потенциала новых штаммов молочнокислых бактерий с криорезистентными свойствами

На основе анализа биотехнологических свойств микроорганизмов во всем мире создаются различные варианты заквасок, состоящих из монокультур или же их сочетаний; комплексных заквасок с другими группами микроорганизмов, позволяющие в максимальной степени реализовать биотехнологический потенциал отдельных штаммов и их консорциумов [1–6].

Промышленно-ценными культурами микроорганизмов, применяемых в составе большинства заквасок для пищевых продуктов, в том числе и хлебобулочных изделий, являются молочнокислые бактерии, относящиеся к роду Lactobacillus , и проявляющие высокую ферментативную активность, устойчивость к кислотам, солям и др., а также синтезирующие широкий спектр биологически активных соединений [7–11]. Особый интерес представляют протеолитические ферменты молочнокислых бактерий, которые в основном формируют текстуру, специфический вкус и аромат ферментированных пищевых продуктов, влияют на их биологическую ценность [12–15].

В настоящее время в хлебопекарной промышленности наметилась стойкая тенденция к росту выпуска замороженных тестовых полуфабрикатов, однако при реализации процессов криогенной технологии хлеба наблюдается ухудшение качественных характеристик готовой продукции, связанного в первую очередь с гибелью микрофлоры при низкотемпературном хранении [16–19], в связи с чем работа, направленная на поиск и разработку новых стартовых заквасок с криорезистентными свойствами является актуальной.

Целью настоящей работы является поиск устойчивых к низкотемпературному воздействию штаммов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus и оценка их биотехнологического потенциала.

Материалы и методы

В ходе многолетней работы по поиску криорезистентных функционально-активных штаммов молочнокислых бактерий из различных пищевых источников растительного и животного происхождения нами было отобрано 15 перспективных штаммов молочнокислых бактерий р. Lactobacillus , обладающих высокой устойчивостью к низкотемпературному воздействию (выживаемость клеток при температуре -30 ℃ не менее 80%). Данные штаммы хорошо размножаются в широком диапазоне температур от 15 до 45 °С, температурный оптимум составляет 30–37 °С, оптимальное значение рН = 5,5–6,2 [6, 20].

Оценку функционально-технологических свойств штаммов оценивали по способности их к кислотообразованию при росте на обезжиренном молоке, активности его сквашивания, количеству клеток молочнокислых бактерий, степени синерезиса, вязкости и плотности сгустка. О протеолитической активности молочнокислых бактерий судили по количеству неосаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктов бактериального протеолиза [20], в качестве субстрата использовали 1% растворы сывороточного альбумина и казеина. Антагонистические свойства штаммов оценивали измерением зон подавления роста тест-культур патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [3]. Оценку чувствительности штаммов к антибиотическим веществам проводили по диаметру зоны задержки роста исследуемых штаммов вокруг дисков, пропитанных антибиотиками [3, 21]. Для изучения устойчивости штаммов к неблагоприятным условиям проведены исследования по сравнительной выживаемости штаммов молочнокислых бактерий при экспозиции 24 ч в жидкой среде с различными концентрациями желчи (20 и 40%), фенола (0,4%) и соли (6,5%) [3].

Результаты

В настоящей работе проведено сравнительное изучение важных функциональнотехнологических свойств ранее выделенных штаммов криорезистентных молочнокислых бактерий с целью выявления перспективных для применения их в производстве хлебобулочных изделий на основе замороженных полуфабрикатов. Выбор штаммов молочнокислых микроорганизмов проводили с учетом важнейших функциональных свойств – энергии кислотообра-зования, антагонистической активности, синтезу протеолитических ферментов, по способности сохранять активность в неблагоприятных условиях окружающей среды.

Все изучаемые штаммы быстро ферментируют молоко, образуя при этом сгустки плотной однородной консистенции с чистым кисломолочным вкусом, исключение составляют штаммы, относящиеся к видам L. fermentum и L. brevis , образующие рыхлые сгустки с отделением сыворотки. Выявлено, что все штаммы хорошо развиваются при рН = 3 и в щелочной среде при рН = 9,2, однако снижение рН до 2,0 ингибирует рост большинства лактобактерий (таблица 1).

Установлено, что процент выживаемости клеток в присутствии в жидкой среде различных концентраций NaCl, фенола и желчи существенно зависит от вида и штамма криорезистентных лактобактерий (рисунок 1).

Таблица 1.

Способность штаммов к росту и кислотообразованию

Growth and acid-forming ability of strains

Table 1.

Штамм Strain	Рост Growth		Выживаемость, % Survival , %			Ферментация молока Fermentation of milk
	15 ℃	45 ℃	рН 2,0	рН 3,0	рН 9,2	Время, ч Time, h	Кислотность, °Т Асiditу, °Т	рН	Lg LAB
L. casei 1	+	-	-	17,1	80,2	6	106	4,64	10,34
L. casei 7	+	-	2,4	24,3	63,8	6	108	4,63	10,25
L. casei 16	-	+	10,2	28,0	70,5	7	108	4,70	10,0
L. casei 23	-	+	7,1	21,5	67,7	6	110	4,68	9,72
L. casei 32	+	+	10,8	28,6	72,9	4	120	4,59	10,48
L. casei 36	+	-	4,4	29,4	59,8	6	110	4,71	10,27
L. fermentum 10	+	-	13,5	36,8	77,1	7	104	4,70	9,73
L. fermentum 12	+	+	4,0	11,9	81,4	8	106	4,76	9,98
L. fermentum 13	+	-	12,6	34,5	72,8	6	100	4,75	9,58
L. fermentum 24	+	-	7,9	19,7	96,1	7	112	4,77	10,38
L. plantarum 1	+	-	-	15,9	74,0	6	104	4,71	9,89
L. plantarum 21	+	-	2,9	19,2	64,3	6	102	4,70	9,18
L. acidophilum 9	-	+	18,3	41,6	76,9	4	119	4,62	9,32
L. bavaricus 6	-	+	15,6	49,0	79,4	6	112	4,67	10,28
L. brevis 3	+	-	2,2	16,2	84,8	14	76	5,00	8,69

Выживаемость штаммов, %  | Survival of strains, %

Рисунок 1. Устойчивость штаммов к неблагоприятным факторам окружающей среды

Figure 1. Resistance of strains to unfavorable environmental factors

При внесении в питательную среду желчи в количестве 20 и 40% наблюдается ингибирование роста и кислотообразования, так степень выживаемости клеток при концентрации желчи 20% составляет 20–69%, а при концентрации 40% – 12–36% в зависимости от штамма.

Установлено, что все исследуемые лактобактерии проявляют устойчивость к присутствию в среде фенола в количестве 0,4% и способны развиваться в присутствии хлорида натрия в концентрации 6,5%.

Все штаммы обладают выраженной анто-гонистической активностью по отношению к E. coli и B. subtilis. Некоторые исследуемые штаммы (L. casei 16, L. casei 23, L. fermentum 10 и L. bavaricus 3) проявляют антагонистическую активность по отношению S. aureus, L. casei 23, L. casei 32 ингибируют рост Pr. vulgaris. По отношению к Ps. aeruginosa исследуемые штаммы проявляют низкую активность. Следует отметить, что многие штаммы молочнокислых бактерий не проявляют ингибиторную активность по отношению к плесневым грибам и дрожжам, максимальной антагонистической активностью обладают L. casei 32, L. casei 36, L. fermentum 10 и L. plantarum 24 (таблица 2).

Таблица 2.

Антимикробный спектр действия криорезистентных молочнокислых бактерий

Table 2.

Antimicrobial spectrum of action of cryoresistant lactic acid bacteria

Тестовые штаммы Test-strains	Штаммы молочнокислых бактерий | Strains of lactic acid bacteria
	1 1	2 1	3 1	4 1	5 1	6 1	7 1	8 1	9 1	10 1	11 1	12 1	13 1	14 1	15
	Ингибирующий эффект, мм | Inhibitory effect, mm
Staphylococcus aureus	-	6	12	10	12	4	14	4	10	8	2	2	-	18	-
Escherichia coli	25	14	20	22	27	18	28	22	20	22	14	15	16	30	24
Proteus vulgaris	7	4	9	10	10	6	2	2	6	4	2	5	8	8	2
Bacillus Subtilis	14	16	18	18	25	23	21	19	20	24	15	18	18	11	12
Pseudomonas aeruginosa	5	-	-	-	8	4	2	4	2	3	-	-	-	3	2
Penicillium chrysogenum	-	-	-	-	12	11	15	-	-	10	-	-	-	-	-
Fusarium oxysporum	-	-	8	-	10	10	16	-	-	8	-	-	-	6	-
Aspergillus niger	-	-	6	-	14	10	12	-	-	8	-	6	-	6	-
Candida guilliermondii	-	-	-	-	17	14	10	-	-	10	-	4	-	11	-

Оценка устойчивости молочнокислых бактерий к антибиотикам показала, что большинство штаммов проявляют устойчивость к неомицину, карбенициллину, канамицинуну и ристомицину, кроме того, штаммы L. casei 32, L. casei 36, L. plantarum 24 и L. bavaricus 6 проявляют резистентность к стрептомицину и метициллину. Установлено, что все исследуемые штаммы высокочувствительны к тетрациклину, бензилпенициллину, левомицетину, рифамицину, цефалексину и цефалотину, за исключением L. fermentum 24 , который резистентен к бензилпенициллину, рифамицину. Штаммы L. casei 23, L. plantarum 1 и L. brevis 3 проявляют чувствительность к линкомицину, L. plantarum 1, L. plantarum 21, L. fermentum 1 2 – к доксицилину.

Результаты исследования протеолитической активности исследуемых штаммов (рисунок 2) показали, что в процессе ферментации казеина наблюдается интенсивное снижение количества протеина относительно контроля, наиболее выраженные изменения характерны для штаммов L. casei 32. L. casei 36, L. fermentum 10, L. acidophilum 9, для данных молочнокислых бактерий степень гидролиза казеина составляет в среднем 75–80%. Наименьшую способность гидролизовать белки продемонстрировали штаммы L. casei 16, L. plantarum 1, L. bavaricus 6 степень гидролиза казеина данными лактобактериями составляет 45,2%, 32,8% и 36,7% соответственно. Аналогичные результаты были получены при оценке протеолитической активности исследуемых штаммов молочнокислых бактерий при ферментации альбумина, однако способность микроорганизмов гидролизовать данный белок ниже в среднем на 10–15% по сравнению со степенью протеолиза, продемонстрированной на казеине.

Рисунок 2. Степень гидролиза белков криорезистентными штаммами лактобактерий

Figure 2. Degree of protein hydrolysis by cryoresistant Lactobacillus strains

Обсуждение

Анализ полученных результатов показывает, что по технологическим показателям все штаммы подходят для производственных целей, за исключением L. brevis 3 , что подтверждают данные об изучении активности свёртывания обезжиренного молока (не более 8 ч), конечные значения рН среды и титруемой кислотности, высокие показатели жизнеспособных клеток (не менее 10⁹ КОЕ/см³), качество молочного сгустка.

Установлено, наибольшей кислотоустойчи-востью отличаются L. acidophilum и L. bavaricus , данные штаммы способны развиваться в кислой среде при рН = 2,0. Все штаммы развиваются при рН = 3,0, больший процент выживаемости у штаммов L. bavaricus 6 – 49%, L. acidophilum 9 – 41%, L. fermentum 10 – 36% и L. fermentum 13 – 34%. Значение рН = 9,2 не ингибирует рост и развитие тестируемых штаммов бактерий (процент жизнеспособных клеток 65–95%), наибольшей устойчивостью к щелочным значениям рН отличаются штаммы L. plantarum 24 и L. brevis 3 – 96% и 84% соответственно.

В результате проведенных исследований выявлены наиболее устойчивые к желчи штаммы – L. bavaricus 6, L. casei 32, L. casei 23, L. plantarum 24 и L. plantarum 21 .

Штаммы L. plantarum 21, L. bavaricus 6, L. fermentum 24, L. casei 16 и L. casei 32 продемонстрировали достаточно высокий уровень выживаемости (более 30%) клеток при концентрации NaCl в среде культивирования 6,5%. Данные штаммы, за исключением L. casei 16, являются наиболее перспективными по показателю толерантности к фенолу, выживаемость клеток при дозировке фенола 0,4% превышает 30%.

В результате изучения спектров антибиотического действия криорезистентных молочнокислых бактерий выявлены штаммы, способные эффективно подавлять рост бактерий, мицелиальных грибов и дрожжей – L. casei 32, L. casei 36, L. fermentum 10 и L. fermentum 24 .

Особую устойчивость к ряду антибиотиков проявляют три криорезистентных штамма молочнокислых бактерий – L. casei 32, L. plantarum 24 и L. bavaricus 6 .

Анализ полученных данных по изучению влияния штаммов молочнокислых бактерий на содержание продуктов гидролиза в модельных белковых системах свидетельствуют о высокой протеолитической способности культур L. casei 32, L. casei 36, L. fermentum 10, L. acidophilum 9, при чем данные штаммы молочнокислых бактерий эффективно воздействует не только казеин, но и на альбумин.

Заключение

Результаты комплексного изучения функционально-технологических свойств штаммов молочнокислых бактерий показали, что все исследуемые штаммы могут быть использованы в пищевой промышленности, так как удовлетворяют главным технологическим требованиям к стартовым культурам ферментируемых продуктов питания. Четыре штамма молочнокислых бактерий – L. bavaricus 6, L. casei 32, L. plantarum 21 и L. plantarum 24 характеризуются как наиболее устойчивые к неблагоприятным факторам среды (таким как низкое значение рН, высокие концентрации желчи, NaCl и фенола), что служит основой для прогнозирования их пробиотических свойств, то есть способности сохранения ферментативной активности при прохождении через желудочно-кишечный тракт и приживаемости в кишечнике; три из которых – L. bavaricus 6, L. casei 32 и L. plantarum 24 проявляют наибольшую антибиотикоустойчивость и антагонистическую активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Кроме того, данные штаммы демонстрируют высокую протеолитическую активность, что позволяет сделать вывод о перспективности их применения в технологии ферментированных продуктов питания. Таким образом, проведенные исследования позволяют рекомендовать штаммы молочнокислых бактерий – L. casei 32, L. bavaricus 6 и L. plantarum 24 для дальнейшего использования в пищевой промышленности в технологии функциональных пищевых продуктов.

Представленные в данной статье результаты по оценке биотехнологического потенциала новых штаммов молочнокислых бактерий с криорезистентными свойствами в дальнейшем послужат для разработки консорциума новых стартовых заквасок на основе лактобактерий для хлебобулочных изделий на основе замороженных полуфабрикатов.