Оценка динамики переработки лактозы дрожжами рода Kluyveromyces на основе метода Бенедикта

На молокоперерабатывающих предприятиях ежедневно производятся тонны побочного продукта – молочной сыворотки, в которой остается значительное количество лактозы. В настоящее время, большая часть сыворотки далее никак не используется и утилизируется путём простого слива. Зачастую такая «утилизация» наносит ощутимый вред окружающей среде [1].

Самый широко используемый способ утилизации лактозы – переработка их микроорганизмами. Дрожжи рода Kluyveromyces, относящихся к семейству сахаромицетных, обладают способностью перерабатывать лактозу в этанол в анаэробных условиях [2].

Для проверки качества утилизации используют разные методы определения динамики лактозы в продукте переработки. Обычно, на производствах, для определения редуцирующих сахаров выбирают метод 3,5-динитросалициловой кислоты (ДНС) или фенол-серный метод. Однако эти методы очень дороги и могут сильно загрязнить окружающую среду. При количественном определении редуцирующих сахаров в растворе наиболее простым и дешевым способом является определение с помощью спектрофотометрии [3].

Качественный метод Бенедикта был разработан Стэнли Р. Бенедиктом для качественного определения глюкозы в моче.

Этот метод до сих пор используется для качественного определения редуцирующих сахаров в клинике, промышленности и исследованиях. Механизм реакции основан на восстановительной способности свободных карбонильных групп в глюкозе, которые способны восстанавливать широкий спектр ионов металлов, включая ионы Cu 2+ [4].

Авторы исследования [3] предложили модификацию метода Бенедикта. С помощью спектрофотометрии количественно определять восстанавливающие сахара по оценке полученного сульфата меди после реакции восстановления.

Цель настоящего исследования – определение возможности применения модифицированного метода Бенедикта для оценки количества лактозы в молочной сыворотке при ее микробиологической переработке.

Материалы и методы.

Калибровочный график, составленный по протоколу количественного определения восстанавливающих сахаров, предложенный A. Hernández-López [3], оказался недостаточно точный (коэффициент детерминации R2 = 0,67) (рис. 1). В следствии этого, было принято решение адаптировать протокол для оценки динамики переработки лактозы.

Рис. 1. Калибровочный график, построенный по предложенному протоколу

Используя различные варианты концентраций, объёма растворов, времени нагрева и центрифугирования удалось достичь оптимальной точности метода.

Измененный протокол выглядит следующим образом: сначала необходимо соединить в пробирке 1 мл реактива Бенедикта и 0,25 мл образца, затем инкубировать в течение 15 минут при 95℃, далее центрифугировать при 6000 g в течение 5

минут. Следующим шагом разбавить супернатант дистиллированной водой в соотношении 1 к 4 соответственно и провести спектрофотометрическое измерение на длине волны 740 нм.

Калибровочный график, построенный на основе разработанного протокола, показал высокий уровень точности (коэффициент детерминации R2 = 0,98) (рис. 2).

Рис. 2. Калибровочный график, построенный по адаптированному протоколу

Для изучения лактозоперерабатывающей способности дрожжей рода Kluyveromyces были использованы два коммерческих штамма дрожжей – дрожжевая культура Kluyveromyces lactis и дрожжевая культура Kluyveromyces marxi-anus (ООО Современные технологии) и два вида молочной сыворотки.

Для исследования были составлены 4 группы образцов:

• 1    – дрожжи K. lactis и молочная сыворотка №1.

• 2    – дрожжи K. lactis и молочная сыворотка №2.

• 3    – дрожжи K. marxianus и молочная сыворотка №1.

• 4    – дрожжи K. marxianus и молочная сыворотка №2.

Глубинное культивирование дрожжевых культур проводилось в закрытых химических пробирках при поддержании необходимой постоянной температуры в течении 3 дней. В каждую пробирку для культивирования было добавлено: подсырная сыворотка – 12 мл и дрожжевая суспензия – 2 мл. Для каждого сочетания было взято 5 повтора во избежание погрешностей во время культивирования.

Результаты и их обсуждение.

Результаты измерений динамики лактозы по предложенному протоколу представлены в таблице. Расчет концентрации лактозы в образцах производился по уравнению регрессии калибровочного графика.

Таблица. Средние значения оптической плотности и концентрации лактозы для каждой группы образцов

№ группы образцов	Момент измерения	Средняя оптическая плотность в группе образцов	Средняя концентрация лактозы в группе образцов
1	До культивирования	0,215	3,65%
	После культивирования	1,860	≤ 0,1%
2	До культивирования	0,293	3,48%
	После культивирования	1,840	≤ 0,1%
3	До культивирования	0,215	3,65%
	После культивирования	1,537	0,62%
4	До культивирования	0,293	3,48%
	После культивирования	1,620	0,43%

В ходе исследования модифицированный метод Бенедикта для количественной оценки содержания лактозы показал свою эффективность для определения динамики переработки лактозы дрожжами рода Kluyveromyces. Данный метод может быть рекомендован к использованию на молокоперерабатывающих предприятиях. Его преимущество заключается в простоте дешевизне и безопасности для окружающей среды.