Оценка фагоцитарной активности клеток крови тиляпии в условиях индуцированного гормонами стресса

Актуальность

Стресс у культивируемых рыб является все более изучаемой темой из-за его влияния на рост [1], размножение [2], функционирование защитных систем: иммунитета и гемостаза [3] и, в конечном счете, на приспособленность животного. Наиболее полно влиянию стресса на восприимчивость рыб к болезням и функционированию иммунной системы посвящены работы G.A. Wedemeyer [4] и L. Tort [5]. Влияние синтетических гормонов (дексаметазон и гидрокортизон) на структуру и функцию иммунной системы некоторых видов рыб подробно описаны в работе Д.В. Микрякова [6].

При оценке реакции клеточного звена иммунитета рыб на различные виды стресса в первую очередь необходимо обратить внимание на наиболее филогенетически древний неспецифический врожденный фактор иммунной защиты ‒ фагоцитарную активность клеток крови. Фагоцитоз характерен для нейтрофилов, моноцитов крови и макрофагов в почках, селезенке, тимусе, печени, лейдиговом органе, стенках кишечника [7]. Фагоцитарная активность лейкоцитов рыб зависит от температуры среды [8]. У рыб в определенных условиях отмечают фагоцитоз эритроцитов [9; 10] благодаря тому, что они имеют сходные с клетками белой крови изменения в цитоскелете [11], а также тромбоцитов [8], причем именно сенсибилизированные лейкоциты активизируют фагоцитоз тромбоцитов благодаря растворимым факторам [12]. Имеющиеся данные говорят о снижении способности фагоцитировать бактерии под воздействием стресс-реакции у лейкоцитов в результате температурного воздействия [13], снижения кислотности среды [14], введения кортизола [15], увеличения плотности посадки [16]. Другие эксперименты отмечают усиление фагоцитарной активности лейкоцитов и эритроцитов рыб, вместе с коагуляцией, в результате комбинированного стресса [17], изменения солевого состава воды [18] и метеорологических параметров [19]. У тиляпии количественно охарактеризовано увеличение фагоцитарной способности эритроцитов к определенным патогенам в результате гипо- и гипертермического воздействия [20].

Иммуносупрессия, оцененная по косвенным признакам (устойчивость к заражению) была вызвана введением такого синтетического кортикостероида, как триамцинолон [21]. Другие авторы [22] обнаружили, что даже незначительное хроническое повышение уровня кортизола снижает сопротивляемость рыб к болезням, вероятно, из-за нарушения функций как В-, так и Т-лимфоцитов, и это часто связано со снижением устойчивости к патогенам (бактериям, грибам, простейшим или вирусам) или экспериментальному заражению [3].

Данные о количественном анализе фагоцитарной активности различных клеток крови тиляпии под влиянием синтетических кортикостероидов в литературе отсутствуют.

Целью работы было изучение изменений фагоцитарной способности ядерных клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов) тиляпии в условиях длительной и кратковременной гормональной индукции.

Материалы и методы

Работа выполнена в центре развития аквакультуры «АкваБиоЦентр» Вологодской ГМХА имени Н.В. Верещагина в рамках реализации гранта РФФИ №19-3490109 («Аспиранты»).

Эксперимент проводили на 30 тиляпиях Oreochromis niloticus L. Рыб каждого вида в соответствии с видом гормонального воздействия предварительно раздели- ли на группы (таблица): рыбы с имитацией острого стресса (первая экспериментальная группа), рыбы с имитацией хронического стресса (вторая экспериментальная группа) и контрольные животные. Для имитации острого стресса использовали дексаметазон-фосфат (4 мг/мл) [23], который метаболизируется в течение 4 часов. Животных однократно обрабатывали Дексаметазоном (Эллара, Россия) путем парентеральных инъекций в дозе 0,2 мл или 0,8 мг активного вещества дексамета-зон-фосфата на особь. В качестве глюкокортикоида, имитирующего хронический стресс, однократно применяли суспензию бетаметазона (2,63 мг бетаметазона натрия фосфата + 6,43 мг бетаметазона дипропионата/мл), период выведения которого более 10 дней. Рыбам инъецировали Дипроспан (Schering-Plough Labo N.V., Бельгия) по 0,5 мл на особь, что соответствует 3,5 мг активного вещества, доза которого была определена экспериментальным путем по нормам вещества на массу, установленным в инструкции. Контрольная группа оставалась интактной.

Рыб содержали в экспериментальной установке с обеспечением непрерывной циркуляции воды между аквариумами и принудительной аэрацией при температуре воды 28-30◦C, режим кормления ‒ 1 раз в сутки гранулированным кормом. Перед забором крови рыб анестезировали при помощи добавления в воду гвоздичного масла в дозе 0,033 мл/л [24] с последующей выдержкой в ней 15 минут.

Для оценки состояния клеточного иммунитета определяли фагоцитарную активность (ФА) клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) к Staphylococcus aureus согласно общепринятой методики [25].

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью программного обеспечения Microsoft Excel и STATISTICA 12.0. Значения полученных результатов в работе представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M±m). Достоверность различий показателей крови для множественных независимых выборок определяли с помощью критерия Кроскелла–Уоллеса, для парных зависимых выборок использовали критерий Вилкоксона. Результаты исследования со значением вероятности допущения альфа-ошибки, равные либо менее 5% (р < 0,05), расценивались как статистически значимые. Различие двух показателей считали достоверным, если оно равнялось или превышало свою среднюю ошибку разности в два и более раз.

Результаты

В результате проведенных исследований был зафиксирован факт фагоцитирования Staphylococcus aureus как лейкоцитами, так и эритроцитами в нативных мазках крови тиляпий (рисунок) , а также количественно охарактеризована фагоцитирующая способность этих клеток в зависимости от времени действия гормо-ниндуцированного стресса (см. таблицу).

Рисунок. Процесс фагоцитирования стафилококка лейкоцитами (a) и эритроцитами (b) у тиляпий

Фагоцитарная активность (ФА) – процент лейкоцитов (нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов), способных к связыванию с патогенной микрофлорой и ее перевариванию.

Стоит отметить снижение ФА лейкоцитов у рыб с модуляцией хронического стресса, в отличие от рыб других групп, при 30-ти минутной инкубации на 50% к концу эксперимента по сравнению с исходным значением, тогда как этот показатель у рыб в других группах повысился за тот же период на 19,7‒33,3%.

Динамика ФА лейкоцитов при 60-минутной инкубации у рыб во всех группах оставалась сходной.

ФА лейкоцитов количественно в контрольной и второй экспериментальной группах достигала своего максимума в первый день эксперимента спустя 120 минут инкубации с патогеном, затем, сохраняя отрицательную динамику, снизилась на 70 и 20% соответственно к последнему дню эксперимента. Напротив, ФА лейкоцитов первой экспериментальной группы достигла максимума при таком же времени инкубации на 7-й день на 72,7%, что говорит о краткосрочном иммуностимулирующем эффекте обработки, затем снизилась на 36,8% к концу эксперимента, оставаясь при этом на 9% больше относительно изначального значения.

Из вышеизложенных данных можно заключить, что наиболее деструктивно хронический стресс влияет на начальную ФА лейкоцитов по сравнению с другими группами, тогда как острый стресс имеет сильный иммуностимулирующий эффект на конечную ФА лейкоцитов, длящийся в пределах семи дней.

Анализируя динамику ФА эритроцитов, максимум активности этих клеток крови выявлялся спустя 30 минут инкубации в контрольной группе, затем, претерпев кратковременный спад на 47,2%, она снизилась на 30,5% к концу эксперимента по отношению к исходному. Аналогичная динамика (на 63,2 и 36,7% соответственно) отмечается и у эритроцитов под влиянием острого стресса. Падение активности у эритроцитов второй группы рыб к 21-му дню происходило прямолинейно и составило 49,2%.

Наименьшую активность спустя 60 минут инкубации можно отметить у эритроцитов первой группы рыб, упавшую на 38,2% спустя 7 дней эксперимента и восстановившуюся к его концу. ФА эритроцитов у рыб второй группы при таком же времени инкубации, наоборот, сильно повысилась к 7-му дню на 63,2% и оставалась выше на 47,3% к 21-му дню по сравнению с исходным значением. Эта динамика указывает на острое иммунносупрессивное влияние кратковременного стресса к середине эксперимента и иммуностимулирующее действие хронического стресса к его концу относительно фагоцитарной активности эритроцитов рыб при часовой инкубации их с патогенами.

Значительных изменений ФА эритроцитов при 120-минутной инкубации с патогеном выявлено не было.

Выводы

Таким образом, можно сделать вывод, что у тиляпий в условиях хронического стресса, вызванного синтетическими кортикостероидами, наиболее четко можно проследить его иммуносупрессивное влияние на конечную фагоцитарную активность лейкоцитов и иммуностимулирующее влияние на срединную фагоцитарную активность эритроцитов по сравнению с другими группами к концу эксперимента.

Острый стресс, напротив, стимулирует конечную фагоцитарную активность лейкоцитов и снижает срединную активность эритроцитов в течение недели после воздействия.

Таблица. Динамика параметров фагоцитоза лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов тиляпий в ходе эксперимента

Показатель	До обработки			7-й день				21-й день
	контроль-ная группа (n=10)	первая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	вторая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)		контроль-ная группа (n=10)	первая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	вторая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	контроль-ная группа (n=10)	первая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	вторая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)
30 минут
ФА лейкоцитов, %	1,67± 0,67	1,50± 0,50	2,00± 1,00		2,25± 0,63	1,50± 0,50	2,00± 0,41	2,00± 0,00	2,00± 0,58	1,00
ФА эритроцитов, %	14,40± 2,50#bc	9,80± 2,58bc	10,50± 2,18		7,60± 1,60#	3,60± 0,40*c	8,75± 1,75	10,00± 2,45	6,20± 0,37	5,33± 0,33

Показатель	До обработки		7-й день				21-й день
	контроль-ная группа (n=10)	первая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	вторая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	контроль-ная группа (n=10)	первая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	вторая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	контроль-ная группа (n=10)	первая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)	вторая экспе-римен-таль-ная группа (n=10)
60 минут
ФА лейкоцитов, %	1,10± 0,37bc	1,63± 0,55	1,50± 0,29	2,25± 0,63	2,00± 1,00	2,33± 0,88	2,00± 0,41	1,80± 0,58	1,67± 0,67
ФА эритроцитов, %	6,60± 1,08	6,80± 0,66	4,75± 0,85b	6,20± 0,73	4,20± 1,02*c	7,75± 1,31	7,75± 0,48	6,60± 0,68	7,00± 1,53
120 минут
ФА лейкоцитов, %	5,00± 1,64c	2,75± 0,63	2,50± 0,87	4,40± 1,03c	4,75± 0,85*c	2,25± 0,63	1,50± 0,50	3,00± 0,71	2,00± 0,58
ФА эритроцитов, %	5,80± 0,80	5,20± 1,07b	4,50± 1,26	4,80± 0,97c	3,80± 0,66	5,25± 0,48	8,00± 1,47#	3,60± 0,87	4,33± 0,33
#Различия с показателем первой экспериментальной группы в тот же день эксперимента достоверны (p≤0,05). *Различия с показателем второй экспериментальной группы в тот же день эксперимента достоверны (p≤0,05). b Различия с аналогичным показателем аналогичной группы на 7-й день эксперимента достоверны (p≤0,05). с Различия с аналогичным показателем аналогичной группы на 21-й день эксперимента достоверны (p≤0,05).