Оценка генетического разнообразия в популяциях тувинских лошадей по локусам систем крови и микросателлитным ДНК

Отечественные заводские и локальные породы лошадей, хорошо приспособленные к местным природно-климатическим условиям и устойчивы к заболеваниям, часто обладают уникальным аллелофондом, который представляет собой значительный селекционный резерв (1).

Генетические маркеры позволяют осуществлять мониторинг генеалогической структуры популяций, подбор и отбор животных для селекционных программ с учетом генотипа (2-5). С помощью микросателлитного анализа изучен генофонд, состав популяций, филогенетические связи у ряда уникальных отечественных пород лошадей — хакасской и других аборигенных сибирских (6-8), буденновской (9), башкирской (10) и карачаевской (11). Микросателлиты применяют для молекулярно-генетического сравнения линий и семейств (12, 13), оценки генетического разнообразия (14, 15) и стабильности пород (16), при маркировании генотипов, контроле 679

происхождения (17-19), изучении потоков генов (20). Микросателлиты могут сочетаться с маркерами полиморфизма структурных или митохондриальных генов (17, 21, 22). Системы групп крови благодаря кодоминантному типу наследования антигенных факторов, широкому полиморфизму и сравнительно легкому определению (23, 24) также остаются важными маркерами в популяционных исследованиях (25-28).

Тувинская лошадь ( Equus ferus caballis ), которая по происхождению родственна, но по размерам несколько крупнее монгольской, ценится за приспособленность к круглогодичному пастбищному содержанию в табунах на подножном корме без подкормки и помещений. Она устойчивее к абиотическим и биотическим стрессорам, в том числе патогенам, и мало подвержена заболеваниям (29). В коневодческих хозяйствах республики содержится 68,1 тыс. гол. (30). Основное направление их использования — мясное, средняя живая масса кобыл к концу пастбищного периода — 316±7,2 кг. В структуре поголовья доля кобыл — 35,2-42,5 %, выход жеребят — 58 гол/100 маток (31). Производство конины почти в 3 раза дешевле говядины, что (наряду с наличием благоприятных условий и спроса) определяет целесообразность разведения местных лошадей и повышения их мясной продуктивности, которая сравнительно невелика. В то же время важно сохранить ценные приспособительные качества породы. Поэтому в селекционно-племенной работе необходимо учитывать не только фенотип, но и генотипические характеристики животных.

Отметим, что иммуногенетическим признакам лошадей Тувы посвящена одна работа, в которой изучали системы полиморфных белков крови (24), и только в последнее время началось тестирование по локусам микросателлитов ДНК. Мы впервые в комплексном исследовании популяции тувинской лошади проанализировали сочетание иммуногенетических маркеров (полиморфные белки — трансферрин, альбумин, эстераза; системы групп крови) с молекулярными (микросателлиты ДНК), что позволяет значительно расширить круг маркеров для генетико-селекционных программ.

Целью настоящей работы стало изучение и анализ генетической структуры популяции тувинской лошади по распространенности локусов полиморфных систем крови и полиморфизму микросателлитов ДНК.

Методика . Исследования выполняли в 2009-2016 годах в базовых хозяйствах Тувинского НИИ сельского хозяйства — ГУП «Бай-Тал» и КФХ «Биче-Шивилиг» (Бай-Тайгинский и Кызыльский районы, Республика Тыва) на лошадях ( Equus feru scaballis ) тувинской породы . Биоматериалом служили пробы крови ( n = 32) и образцы волоса с волосяной луковицей ( n = 35). При отборе лошадей для исследования оценивали экстерьер, масть, живую массу и наличие аборигенных признаков. Животных весь год содержали на подножном корме.

Генотипы по локусам белков и ферментов сыворотки крови определяли при горизонтальном электрофорезе в крахмальном геле согласно рекомендациям (32), антигены систем групп крови — в реакции гемагглютинации с моноспецифическими сыворотками производства Всероссийского НИИ коневодства (сертифицирован Международным обществом по генетикe животных — International Society of Animal Genetics, ISAG), идентифицированных с международными эталонами.

ДНК выделяли из волосяных луковиц с применением наборов Di-atomTM DNA Prep и ExtraGeneTM DNA Prep (ООО «Изоген», Москва). Амплификацию проводили с использованием StockMarks for Horses Genotyping Kit Equine («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США) в термоциклере 2720 680

Termal Cycler («Applied Biosystems, Inc.», США) с набором праймеров для 17 локусов микросателлитов, рекомендованных ISAG. Электрофорез продуктов амплификации осуществлялся в автоматическом 4-капиллярном генетическом анализаторе 3130 DNA Analyzer («Applied Biosystems, Inc.», США). Расшифровку и документирование результатов выполняли с помощью программного обеспечения GeneMapperTM v. 4.0 («Applied Biosystems, Inc.», США).

Для характеристики аллелофонда определяли среднее число аллелей (Na) и число эффективных аллелей (Ne) в расчете на локус, рассчитывали наблюдаемую (Ho) и ожидаемую (He) гетерозиготность, степень по-лиморфности (Ae). Генное равновесие в популяции, генетическое сходство и генетическое расстояние оценивали общепринятыми методами (33, 34).

Кластерный анализ выполняли на основании расчета генетических дистанций между породами лошадей по частотам встречаемости аллелей микросателлитных локусов по методу M. Nei (34). При сравнении генетической структуры тувинской лошади с другими породами были использованы ранее опубликованные данные (3, 8).

Статистическую обработку данных проводили в программах MS Excel 2003 и Statistica 6 («StatSoft Inc.», США). В таблицах представлены средние ( X ) и стандартные ошибки средней (± х ). Различия между показателями считали статистически значимыми при Р > 0,95.

Результаты. Анализ по системам групп крови ( n = 17) и полиморфным системам белков крови ( n = 15) выявил выраженное породное своеобразие генетической структуры тувинских лошадей, несмотря на небольшое число исследованных животных. В системе трансферрина обнаружили 5 аллелей — Tf^D , Tf^F , Tf^H , Tf^R и Tf^O . В аллелофонде популяции преобладал аллель Tf^F , частота которого составила 0,324; частота аллелей Tf^H и Tf^R была практически одинаковой (0,235). Сравнительно редко встречался аллель Tf^O (0,029). В локусе альбумина выявили 2 аллеля — ALB^A и ALB^B , при этом преобладал ALB^B (0,559). В локусе эстеразы было 3 аллеля — Es^F , Es^G и Es^I . У исследованных лошадей самым распространенным оказался аллель Es^I (0,559), относительно реже встречались Es^F (0,206) и Es^G (0,235).

Мы определили частоту антигенов трех генетических систем крови (А, К и D). По ЕАА системе тувинские лошади были носителями маркера крови A^a (табл. 1). В системе ЕАК у тувинских лошадей обнаружили антигены, указывающие на присутствие аллелей K^a и K ^- при сравнительно высокой частоте аллеля K^а (0,2941±0,1110).

1. Частота локусов по системам групп крови у тувинских лошадей ( X±x, n = 17, Бай-Тайгинский и Кызыльский районы, Республика Тыва, 2009-2016 годы)

Система EAА	Система TAD	Система EAK
генотип 1 частота	генотип 1       частота	генотип 1	частота

Aa	1,00±0,00	D ad/d	0,0588±0,0570	Ka	0,2941±0,1110
		D bcm/dghm	0,0588±0,0570	K -	0,7059±0,1110
		D bcm/cgm	0,1176±0,0780
		D bcm/d	0,1176±0,0780
		D cgm/d	0,0588±0,0570
		D cgm/de	0,1765±0,0920
		D cgm/dk	0,0588±0,0570
		D cgm/cgm	0,0588±0,0570
		D cgm/dghm	0,2941±0,1110

Большое разнообразие отмечалось по частоте антигенных факторов в системе ЕАD. У лошадей эта система групп крови — наиболее сложная (включает 17 антигенов, которые образуют более 30 феногрупп) и считает- ся самой информативной для понимания генезиса пород. Полученные нами данные (см. табл. 1) свидетельствовали о доминировании в местной породе генотипа Dcgm/dghm, частота которого составила 29,41 %. Сравнительно высокую частоту демонстрировали аллели Dcgm, Dbcm и Dd, относительно редкими оказались аллели Dad, Dde и Ddk.

При исследовании полиморфизма микросателлитной ДНК у ту- винских лошадей в 17 локусах обнаружили 113 аллелей, или в среднем 6,65 аллеля на локус, что свидетельствует о высоком генетическом разнообразии в породе (табл. 2). В ряде локусов были выявлены редкие аллели VHLP, АНТ4P, HMS7J, ASB23L, ASB2B, HMS3N, ASB17Q, LEX3K, LEX3P, HMS1I, HMS1N и HMS1R. Следует специально отметить наличие у тувинских лошадей очень редкого аллеля HMS1R (0,014), который не обнаружен в популяциях лошадей европейского происхождения (18).

Тестирование показало, что для тувинских лошадей характерен значительный полиморфизм

2. Частота гетерозиготности ( Н_o) по 17 микросателлитным локусам у тувинских лошадей ( X ± x , n = 35, Бай-Тай-гинский и Кызыльский районы, Республика Тыва, 2009-2016 годы)

Локус	Аллели		Н o
	число	набор
VHL20	9	I, J, L, M, N, O, P*, Q, R	0,771
HTG4	6	K, L, M, N, O, P*	0,600
AHT4	9	H, I, J, K, L, M, N, O, P*	0,857
HMS7	5	J*, L, M, N, O	0,771
HTG6	5	G, I*, J, M*,O	0,714
AHT5	6	J, K, L, M, N, O	0,743
HMS6	5	K, L, M, O, P	0,857
ASB23	8	G*, H*, I, J, K, L, S, T, U	0,857
ASB2	9	B*, C*, I*, K, M, N, O, P, Q	0,800
HTG10	7	I*, K, M, O, Q, R, S*	0,714
HTG7	4	K, M, N, O	0,829
HMS3	6	I, M, N*, O, P, Q, R	0,886
HMS2	5	H, I, J, K, L	0,794
ASB17	10	G, I, J, K, L, N, P, Q*, R	0,943
LEX3	7	F, H, I, L, M, N, P	0,886
HMS1	6	I*, J, K, M, N*, R*	0,514
CA425	6	I, K, L, M, N, O	0,800
Прим еч ани е. Звездочкой отмечены редкие аллели.
Аллель R, выявленный в локусе HMS1, не встречается

по ряду микросателлитных локусов. Это свидетельствует о весьма высоком генетическом разнообразии в популяции. В изученных микросателлитных локусах выявили от 4 до 9 аллелей, среднее число эффективных аллелей на локус (Ае) составило 4,20, что считается достаточно высоким показателем даже для местных пород лошадей. Наиболее разнообразный спектр аллелей имели локусы ASB17 (10 аллелей), АНТ4, VHL20 и ASB2 (по 9 аллелей) и ASB23 (8 аллелей). Уникальность генетической структуры тувинской породы была подтверждена результатами кластерного анализа (рис.).

у европейских пород лошадей.

Дендрограмма генетических дистанций по M. Nei между породами лошадей по 17 локусам микросателлитов ДНК (данные В.В. Калашникова с соавт.) (3).

При обследовании лошадей в КФК «Биче-Ши-вилиг» (n = 11) в 9 из 16 изученных микросателлит-ных локусов вывили 12 дополнительных аллелей, которые встречались с частотой < 5 %, что свидетельст- вует о высокой генетической пластичности породы. Среднее значение Но по микросателлитным локусам у тувинских лошадей из этого хозяйства составило 0,721 с колебаниями от 0,480 до 0,960.

Генетико-популяционный анализ продемонстрировал хорошее со- ответствие показателей наблюдаемой (Но = 0,748) и ожидаемой (Не = 0,742) гетерозиготности микросателлитных локусов и отсутствие внутрипородно-го инбридинга у тувинской лошади (FIS = -0,008). При сравнении пород наибольшую степень генетического сходства проявили тувинская и хакасская (0,823) а также тувинская и монгольская (0,822) лошади, ареалы которых граничат на юге и юго-востоке. Общность происхождения тувинских и монгольских лошадей, образующих одну общую ветвь в древе эволюции конских пород, подтверждается и результатами полногеномного ассоциативного анализа (35).

Таким образом, изучение локусов систем крови и микросателлит-ной ДНК показало, что у тувинской лошади проявляется генетическая изменчивость по аллелям как структурных генов, так и микросателлитов. По полиморфности структурных генов выделились локусы трансферрина, альбумина, эстеразы и особенно системы D групп крови, где имелись как часто, так и относительно редко встречающиеся аллели. Полиморфизм мик-росателлитной ДНК в среднем составил 6,65 аллеля на локус, что свидетельствует о высоком генетическом разнообразии в породе. В ряде локусов выявлены редкие аллели и аллель HMS1R, который не встречается у европейских лошадей. Локусы ASB17, АНТ4, VHL20, ASB2 и ASB23 были представлены наиболее разнообразным спектром аллелей. Тувинская лошадь генетически наиболее сходна с хакасской (0,823) и монгольской (0,822), с которыми граничит ареалами. Выявленный оригинальный аллелофонд тувинской лошади, включающий ряд редких аллелей, важно сохранить в породе при дальнейшем разведении и при селекционной работе. Селекционное улучшение тувинской лошади, для которой характерна генетическая пластичность, представляется весьма перспективным.