Оценка иммуногенных свойств противотуберкулезного препарата у лабораторных животных и крупного рогатого скота

Туберкулез крупного рогатого скота во многих странах мира и Российской Федерации остается одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии, против туберкулеза и микобактериозов нет достаточно эффективных средств специфической профилактики и лечения.

Эпизоотическую обстановку по туберкулезу осложняет проявление неспецифической (парааллергической) реактивности крупного рогатого скота к туберкулину, влекущей неясность эпизоотической ситуации, необоснованный убой продуктивных животных, потерю продукции и приплода, ограничение племенной работы; также наличие парааллергических реакций требует выполнения большого объема работ по санации помещений и территории ферм со значительными необоснованными материальными затратами. Природа парааллергии животных к туберкулезу обусловлена в основном микобактериями птичьего вида, авиумподобными и атипичными микобактериями [1, 2].

Известно, что иммунная система является первой мишенью при воздействии на организм вредных факторов физического, химического, биологического генеза. Патогенные микроорганизмы, условно патогенная микрофлора, обладая уникальной способностью к изменчивости и адаптации, повышают свою вирулентность, способность преодоления естественных защитных барьеров. Эти и другие факторы влияют на становление иммунной системы на ранних этапах онтогенеза, вызывая у плода и новорожденного нарушения в ней, сопровождающиеся снижением иммунного ответа, развитием толерантности, иммунодефицитных состояний [3].

С целью регуляции и восстановления защитных функций организма при заболеваниях и воздействии дестабилизирующих факторов окружающей среды ранее нами была разработана технология получения специфического иммуномодулятора микробного происхождения (КИМ-М2) [4], результаты испытания которого представлены в статье.

Объекты и методы

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных» в период с 2011 по 2015 г., где условия соответствуют работе с возбудителями инфекционных заболеваний III–IV групп патогенности (лицензия № 77.99.18.001.Л.000128.08.10 от 11.08.2010 г. на осуществление деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных и санитарно-эпидемиологическое заключение № 55.01.07.000М001168.05.10 от 30.05.2010 г., предоставленные Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека).

С целью сравнительной оценки протективных (иммуногенных) свойств КИМ-М2 и вакцины БЦЖ из 30 морских свинок сформировали 3 экспериментальные группы по 10 животных: 10 морских свинок иммунизировали КИМ-М2 подкожно в дозе 0,5 мг/мл белка (1-я группа); 10 морским свинкам привили вакцину БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора (2-я группа) и 10 интактных морских свинок использовали в качестве контрольной, 3-й группы. Через 30 сут после иммунизации животных инфицировали M. bovis штамм 14 подкожно в дозе 0,001 мг/мл, через 30 сут убили для патолого-анатомических исследований.

С целью оценки иммунного статуса и протективных свойств в зависимости от кратности введения КИМ-М2 провели опыт на 25 морских свинках: 5 морских свинок иммунизировали КИМ-М2 первый раз в дозе 0,125 мг/мл белка, второй раз через 15 сут в дозе 0,25 мг/мл белка и в третий раз через 30 сут 0,5 мг/мл белка (1-я группа); 5 морских свинок иммунизировали КИМ-М2 первый раз в дозе 0,25 мг/мл белка, второй раз через 30 сут 0,5 мг/мл белка (2-я группа); 5 морских свинок иммунизировали КИМ-М2 однократно через 30 сут в дозе 0,5 мг/мл белка (3-я группа); 5 привили вакциной БЦЖ через 30 дн. в дозе 0,1 мг (4-я группа) и 5-я группа морских свинок была контрольной. Всех свинок через 30 сут после иммунизации заразили вирулентной культурой M. bovis штамм 14 подкожно в дозе 0,001 мг/мл и через 30 сут убили для патолого-анатомического исследования. До иммунизации, перед заражением и убоем морские свинки были исследованы ППД-туберкулином для млекопитающих.

С целью оценки иммунотерапевтических свойств КИМ-М2 19 морских свинок инфицировали вирулентной культурой M. bovis штамм 14 подкожно в дозе 0,001 мг/мл. Затем через 14 сут после инфицирования 5 морских свинок иммунизировали КИМ-М2 подкожно в дозе

0,5 мг/мл белка (1-я группа); 4 морских свинок иммунизировали КИМ-М2 через 21 сут тем же методом (2-я группа); 5 морских свинок иммунизировали также через 28 сут (3-я группа); 5 интактных морских свинок были контрольными (4-я группа). Через 30 сут после иммунизации и контрольные после инфицирования были убиты.

Содержали свинок в условиях вивария, кормление осуществляли согласно нормам рациона для лабораторных животных. За подопытными вели постоянное наблюдение, в опыт брали только клинически здоровых животных.

Проведено испытание КИМ-М2 на крупном рогатом скоте двух ферм (ООО «Полтава» Таврического района Омской области и СПК «Колхоз Восток» Куйбышевского района Новосибирской области). В течение последних лет на фермах постоянно выделяли реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих: от 0,6 до 9,5 % от числа исследованных животных. При последующих диагностических исследованиях туберкулез был исключен на обеих фермах. КИМ-М2 вводили животным всех групп скота с 10–20-дневного возраста 2 раза в год через 6 мес. – молодняку крупного рогатого скота и один раз в год коровам после исследования ППД-туберкулиновой пробой.

Оценка протективных свойств. При анализе протективных свойств противотуберкулезных препаратов использовали 10-балльную схему С.И. Гельберг, Е.А. Финкель [5], по которой определяли показатель интенсивности поражений при патолого-анатомическом исследовании морских свинок от 0 до 9. Согласно схеме изменения до казеозного распада лимфатических узлов – не превышают 4 баллов, а от 5 баллов сопровождаются казеозным распадом лимфатических узлов, это важный признак патолого-анатомических туберкулезных изменений.

Для оценки напряженности иммунитета применяли индекс защиты, предложенный А.И. Тогуновой [6]. Для расчета индекса из среднего показателя интенсивности поражения контрольной группы вычитали такой же показатель, установленный для опытной группы. Затем полученный остаток (в процентах) делили на средний показатель интенсивности поражения контрольной группы.

Оценивали иммунный статус по методу М.А. Бажина с соавторами [7].

Биометрическую обработку цифрового материала проводили с помощью дискретнодинамического анализа. Для оценки существенности различий между двумя средними величинами М х и М у использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение

Оценка протективных свойств КИМ-М2 и вакцины БЦЖ на морских свинках. Анализ результатов (табл. 1) показал высокий уровень защиты у морских свинок, иммунизированных КИМ-М2 – 70 %, этот уровень сопоставим с уровнем морских свинок, иммунизированных вакциной БЦЖ – 73 %, при этом после введения КИМ-М2 у животных не развивается кожная аллергическая реакция на ППД-туберкулин для млекопитающих, тогда как у привитых БЦЖ она составила 14,1 ± 1,27 мм.

Таблица 1

Результаты оценки протективных свойств КИМ-М2 и вакцины БЦЖ на морских свинках

Группа животных	Кожная аллергическая реакция через 30 дн. после вакцинации, мм			Кожная аллергическая реакция через 30 дн. после заражения, мм			Показатель интенсивности поражений, баллы, M ± m	Индекс защиты, %
	n	Реакция	M ± m	n	Реакция	M ± m
1-я	10	–	–	10	10	13,8 ± 0,90	1,60 ± 0,40*	70
2-я	10	10	14,1 ± 1,27	10	10	11,3 ± 0,70	1,4 ± 0,34*	73
3-я	10	–	–	10	10	12,2 ± 1,00	5,3 ± 0,30	0

* р ≤ 0,05.

Иммунные реакции у морских свинок, неоднократно привитых КИМ-М2. При оценке иммунного статуса в зависимости от кратности введения КИМ-М2 установлено: наиболее низкий индекс защиты (36 %) у морских свинок после трехкратного введения КИМ-М2 (табл. 2), несколько выше (54 %) – у животных после двукратного введения с интервалом 30 сут. и наиболее высокий (59 %) – у морских свинок, иммунизированных однократно КИМ-М2 подкожно в дозе 0,5 мг/мл белка и вакциной БЦЖ, индекс защиты у них также 59 %. Следовательно, дву- и трехкратное введение препарата с коротким интервалом между инъекциями тормозит у морских свинок развитие иммунного ответа и формирование противотуберкулезного иммунитета. Кожная аллергическая реакция на ППД-туберкулиин для млекопитающих развивается после инфицирования M. bovis штамм 14 у всех морских свинок. Очевидно, что иммунизация КИМ-М2 существенно не влияет на уровень кожной аллергической реакции при последующем инфицировании морских свинок вирулентным штаммом микобактерий.

Таблица 2

Оценка иммунного статуса и протективных свойств в зависимости от кратности введения КИМ-М2

Группа животных	Кожная аллергическая реакция через 30 сут. после вакцинации, мм			Кожная аллергическая реакция через 30 сут. после заражения, мм			Показатель интенсивности поражений, баллы M ± m	Индекс защиты, %
	n	Реакция	M ± m	n	Реакция	M ± m
1-я	5	–	–	5	5	11,25 ± 0,94	2,80 ± 0,73	36
2-я	5	–	–	4	4	12,00 ± 1,08	2,00 ± 0,70	54
3-я	5	–	–	5	5	12,0 ± 0,81	1,80 ± 0,73	59
4-я	5	5	9,00 ± 1,18	5	5	6,80 ± 0,66*	1,80 ± 0,73	59
Контроль	5	–	–	5	5	9,80 ± 0,80	4,40 ± 0,24	–

* р ≤ 0,05.

Оценка иммунотерапевтических свойств КИМ-М2. Установлено, что через 30 сут у инфицированных морских свинок после введения КИМ-М2 (табл. 3) выявлена кожная реакция, интенсивность которой зависела от величины интервала между инфицированием культурой M. bovis штамм 14 и введением КИМ-М2.

Так, интенсивность кожной реакции ниже у морских свинок, привитых КИМ-М2 через 14 сут после инфицирования. При патолого-анатомическом исследовании изменения туберкулезного характера не установлены у морских свинок (индекс защиты – 100 %), привитых КИМ-М2 через 14 сут, тогда как у животных, иммунизированных через 21 сут, индекс защиты – 35 % и у иммунизированных через 28 сут – 36 %, но при этом у морских свинок степень пораженности органов достоверно ниже, чем у контрольных.

Таблица 3

Развитие туберкулезного процесса у инфицированных морских свинок после введения КИМ-М2

Группа животных Кожная аллергическая реакция через 30 дн. после введения КИМ-М2 инфицированным животным, мм Показатель интенсивности я поражений, баллы, M ± m Индекс защиты, % n Реагировало M ± m 1-я 5 5 7,80 ± 2,03 Видимые изменения отсутствуют 100 2-я 4 4 8,25 ± 0,63 3,25 ± 0,25* 35 3-я 5 5 10,75 ± 0,75 3,20 ± 0,20* 36 Контроль 5 5 11,40 ± 1,47 5,00 ± 0,44 – р ≤ 0,05.

Опыты, проведенные на морских свинках, показали, что протективные свойства КИМ-М2 сопоставимы с протективными свойствами вакцины БЦЖ, при этом у лабораторных животных не развивалась кожная аллергическая реакция. Это послужило основанием для использования КИМ-М2 при иммунизации крупного рогатого скота.

Экспериментально установлено, что наиболее оптимальна схема иммунизации: специфический иммуномодулятор КИМ-М2 применяют для всех возрастных групп скота с 10–20-дневного возраста 2 раза в год через 6 мес на молодняке и один раз в год на коровах после аллергического исследования. По результатам оценки иммунного статуса у крупного рогатого скота после иммунизации КИМ-М2 количество иммунокомпетентных клеток достоверно (Р < 0,05) увеличивается, усиливается функциональная активность нейтрофилов и уменьшается концентрация циркулирующих комплексов (антиген-антитело), указывая на усиление в организме животных функций противотуберкулезной защиты. Количество коров и молодняка крупного рогатого скота с высокой активностью иммунокомпетентных клеток после иммунизации увеличивается в 2–2,5 раза.

При разработке технологии получения КИМ-М2 нами использован новый принцип, который теоретически обоснован и экспериментально разработан Р.В. Петровым, Р.М. Хаитовым,

В.А. Кабановым и другими [8]. Технология получения специфического иммуномодулятора включает: культивирование вакцинного штамма БЦЖ на синтетических питательных средах; разрушение полученной культуры ультразвуком; выделение антигенного комплекса; смешивание надосадочной жидкости с формалином и ее инкубация в термостате; определение белка и конъюгирование на ПВП и ПЭГ.

Широкое распространение атипичных микобактерий в окружающей среде, в том числе присутствие в молоке, кормах растительного происхождения, при поступлении в организм могут у новорожденных телят индуцировать оральную толерантность, обеспечивая симбиоз организма с атипичными микобактериями. Можно предположить, что в состоянии стресса атипичные микобактерии с целью самосохранения начинают продуцировать стресс-белки (белки теплового шока), которые распознаются иммунокомпетентными клетками с последующей индукцией иммунных реакций, очага воспаления и сенсибилизацией организма к ППД-туберкулину для млекопитающих [9].

В научной литературе обсуждаются результаты применения в стадии ремиссии хронических аллергических заболеваний иммуностимулирующих антигенных препаратов микробного происхождения, а также использование тех или иных адаптационных воздействий [10, 11]. Возникновение хронического патологического процесса лишь косвенно определяет чужеродное, главной причиной является дисбаланс в системе врожденного иммунитета [9].

Испытание КИМ-М2 на крупном рогатом скоте в двух сельскохозяйственных предприятиях с целью специфической профилактики туберкулеза и микобактериозов показало высокую противоэпизоотическую эффективность. Создаваемый в стаде противотуберкулезный иммунитет профилактирует также неспецифические туберкулиновые реакции и исключает необоснованный убой маточного поголовья. Применение КИМ-М2 в схеме специфической профилактики способствует восстановлению у телят утраченной иммунологической реактивности, устранению вторичных иммунодефицитов. Повышенная антигенная нагрузка у животных сопровождается, как установлено, функциональным напряжением иммунной системы. При введении молодым животным КИМ-М2 снижается напряжение, иммунная система спокойно функционирует, устраняются вторичные иммунодефициты.

Заключение

Полученный специфический иммуномодулятор КИМ-М2 обладает иммунотерапевтическими и выраженными протективными свойствами, безвреден для лабораторных и продуктивных животных. Применение препарата на сельскохозяйственных предприятиях способствует профилактике неспецифических реакций на введение ППД-туберкулина. Изучение условий применения КИМ-М2 в системе противотуберкулезных мероприятий крупного рогатого скота будет продолжено.