Оценка эффективности профилактического действия хлеба с добавлением экстракта бурых водорослей

Введение . В настоящее время в мире регистрируется достаточно сложная экологическая ситуация, в результате которой население все в большей степени подвергается воздействию разных ксенобиотиков, являющихся в то же время стрессовыми факторами для организма.

Известно, что основным барьером в организме человека, нейтрализующим токсические вещества, является печень, поэтому весьма значима профилактика ее заболеваний. Одним из механизмов формирования заболеваний печени является образование свободных радикалов и реактивных метаболитов, в связи с чем актуален поиск средств, способствующих ингибированию этих процессов и восстановлению клеток печени - гепатопротекторных и антиоксидантных веществ. Существенный вклад в решение этой проблемы могут внести и пищевые продукты, обладающими гепатопротекторными и антиоксидантным свойствами, особенно продукты ежедневного и массового потребления, к которым относятся и хлебобулочные изделия.

Для придания пищевым продуктам профилактической направленности их обогащают различными биологически активными компонентами, в том числе морского происхождения [1]. Сырьевые ресурсы Дальнего Востока морского происхождения являются колоссальным источником различных биологиче- ски активных веществ (БАВ), применяющихся в медицине, фармакологии, животноводстве и пищевой промышленности.

Одним из таких БАВ являются водно-спиртовые экстракты из морских водорослей, обладающие широким спектром доказанной медико-биологической активности (противомикробной [2, 3], противоопухолевой, цитотоксической, противовирусной и т. п. [4]), что свидетельствует о перспективности их использования в качестве ингредиентов продуктов позитивного питания.

Ранее нами был разработан хлеб с добавлением водно-этанольного экстракта бурых водорослей фукус исчезающий (Fucus evanescens) , являющегося побочным продуктом комплексной переработки этих водорослей с целью получения различных композиций БАВ, биологически активных добавок к пище (БАД) на основе фукоидана [5]. Все виды композиций на основе фукоидана, в том числе водно-этанольный экстракт (далее по тексту - экстракт), разработаны сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии (ТИБОХ) ДВО РАН по оригинальной технологии, защищенной патентами, обладают высокой биологической активностью, аргументированной с позиций доказательной медицины [6].

Оценка показателей качества и безопасности разработанного нами хлеба с добавлением экстракта показала полное их соответствие всем необходимым требованиям нормативной документации РФ и Евразийского Таможенного союза [7].

Проведение доклинических испытаний разработанного хлеба с добавлением экстракта в экспериментах на животных, стандартных фармацевтических моделях (МУК 2.3.2.721-98) продемонстрировало его стресс-протективное, или адаптогенное, и актопротекторное действие [8].

В число механизмов реализации антистрессор-ного действия БАВ входят их гепатопротекторная и антиоксидантная активность, которая способствует стабилизации перекисного окисления липидов биомембран и, в конечном итоге, повышает сопротивляемость организма к неблагоприятным факторам [9].

Цель исследования : изучение гепатопротектор-ного и антиоксидантного действия хлеба с добавлением водно-этанольного экстракта бурых водорослей фукус исчезающий ( Fucus evanescens) в эксперименте на животных.

Объектом исследования явился хлеб с добавлением экстракта бурых водорослей, разработанный по собственному стандарту организации - СТО 911002067942-015-2012 «Хлеб пшеничный "Океан"».

Методы исследования. В исследовании применяли экспериментальную модель токсического гепа- тита на животных – крысах путем их интоксикации одним из сильных стимуляторов перекисного окисления липидов (ПОЛ) ССl4 – четыреххлористым углеродом (ЧХУ). Масляный раствор ЧХУ в 50 % растворе на оливковом масле однократно, согласно методу, внутрижелудочно вводили животным [10]. Токсическое действие ЧХУ обусловлено, в первую очередь, прооксидантным действием образующихся в процессе его метаболизма свободных радикалов (трихлорметильного и трихлорметилпероксильного), инициирующих ПОЛ, что приводит к глубоким нарушениям функциональных свойств мембран клеток печени, их лизису и гибели [11].

Экспериментальное изучение эффективности включения хлеба с экстрактом в рацион крыс на выбранной модели проводили совместно с сотрудниками кафедры фармации Тихоокеанского государственного медицинского университета (ТГМУ) с разрешения Этического комитета университета.

Исследования проводили на крысах – самцах линии Август , массой 180–200 г, содержащихся на стандартном пищевом рационе . Исследование выполнено с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах.

Проведение эксперимента . Животные были разделены на группы: 1-я группа - интактные животные, находившиеся на стандартной диете; 2-я и 3-я группы - контрольная и опытная соответственно, которым воспроизводили токсический гепатит.

До введения гепатотоксина 2-я и 3-я группы животных получали хлеб профилактически, на протяжении 25 дней, при этом опытная группа получала хлеб с экстрактом бурых водорослей, контрольная группа крыс получала хлеб из той же партии выпечки, но без экстракта . На время приема хлеба с экстрактом каждое животное отсаживали в отдельную клетку, где они получали хлеб с добавкой, рассчитанный на конкретную массу крысы. После поедания хлеба с добавкой животные возвращались в клетки, где они получали обычный суточный рацион. Все эксперименты повторяли трижды.

Об эффективности действия хлеба с экстрактом судили по следующим показателям (сообразно методам исследований) [11–12]:

– определение относительной массы органа – мишени токсического агента - печени (отношение массы печени, мг, к массе тела, г), которая характеризует степень выраженности воспалительных процессов;

– вычисление относительной массы печени (отношение массы печени, мг, к массе тела, г) проводили у опытных групп животных, получавших хлеб с экстрактом, в сравнении с контрольной группой, получавшей обычный хлеб, выпеченный из тех же ингредиентов без добавления экстракта.

Показатели интенсивности ПОЛ печени определяли по малоновому диальдегиду (МДА) – одному из наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов, продукту окислительной деградации жирных кислот.

МДА определяли в печени и крови на основе цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1650 PC). В гомогенатах печени содержание МДА определяли по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. В плазме крови при определении малонового диальдегида в качестве субстрата использовали твин-80, а в качестве инициатора – плазму крови.

Общую антиоксидантную активность (ОАА) измеряли в плазме крови по разрушению окислителя, подобранного для данного индикаторного красителя.

Оценку интегральной антирадикальной активности (ИАА) антиоксидантов проводили по их способности подавлять реакцию окисления ABTS перок-сильными и алкоксильными радикалами (измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-2550 с термостатированной ячейкой).

Индекс интегральной антиоксидантной активности определяли в гепатоцитах печени с применением спектрофотометра ShimadzuUV-1650PC.

Лабораторное определение стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови проводили согласно протоколу для определения NO, утвержденному фирмой Biogenesis (Англия).

Полученные результаты подвергали статистической обработке по программе «Статистика 7.0» с использованием критерия Стьюдента.

Результаты исследования . В таблице 1 представлены результаты изучения относительной массы печени, содержание МДА и ИАА в гомогенатах печени всех групп исследуемых крыс после введения им гепатотоксина.

Как показывают данные таблицы 1, у интактных животных масса печени была минимальна. В опытных группах крыс с токсическим гепатитом по сравнению с интактными животными относительная масса печени увеличивалась, что является одним из показателей интоксикации. При этом у животных контрольных групп, получающих хлеб без экстракта, масса печени возросла на 30,4 % по сравнению с таковой у интактных крыс. У крыс, получающих хлеб с экстрактом водорослей, масса печени увеличилась только на 9,8 %, что свидетельствуют о защитной роли хлеба с добавлением экстракта, включенного в рацион животных.

Таблица 1

Влияние хлеба с экстрактом на относительную массу печени, содержание МДА и индекс интегральной антирадикальной активности в гомогенатах печени исследуемых групп крыс

Группа животных	Относительная масса печени, мг/г массы тела	МДА, нмоль/г сырого веса	ИАА, моль/г сырого веса
Интактные (общий виварный рацион)	21,4±2,0	11,8±1,2	3,9±0,6
Контрольные (хлеб без экстракта)	27,9±2,3	16,5±1,7*	2,2 ± 0,3*
Опытные (хлеб с экстрактом)	23,5±2,1	14,5±1,4	2,6 ± 0,5

* p < 0,05 между контролем и интактными группами .

В липидных экстрактах гомогенатов печени контрольных групп крыс по сравнению с интактными животными снижалась выраженность общей антиоксидантной активности статистически достоверно на 56,4 % и одновременно прогрессировало ПОЛ (зафиксировано повышение малонового диальдегида на 39,8 %).

В гомогенатах печени крыс, получающих хлеб с экстрактом, отмечалась подобная, но менее выраженная динамика изменений в системе показателей «ПОЛ – антирадикальная система», чем в контрольных группах, но не достигшая, однако, физиологических значений интактных крыс.

Полученные данные подтверждают подобную закономерность результатов изучения относительной массы печени у разных групп животных и свидетельствуют о положительном действии рациона с разработанным хлебом на мембраностабилизирующие и процессы перекисного окисления липидов в печени крыс.

В таблице 2 представлены результаты изучения влияния хлеба с экстрактом бурой водоросли на содержание МДА, общую антиоксидантную активность (ОАА), метаболиты оксида азота в плазме крови крыс после введения гепатотоксина .

Таблица 2

Влияние хлеба с экстрактом на содержание МДА, общую антиоксидантную активность (ОАА), метаболиты оксида азота в плазме крови крыс после введения гепатотоксина, (M ± m)

Группа животных	Метаболиты оксида азота, Мкмоль/л	МДА, Мкмоль/г	ОАА, %
Интактные (общий виварный рацион)	1,27±0,13	1,79±0,18	0,53±0,048
Контрольные (хлеб без экстракта)	0,97±0,089*	2,45±0,22*	0,31±0,029*
Опытные (хлеб с экстрактом)	1,15±0,12	1,94±0,18	0,41±0,04

*р < 0,05 между контролем и интактной группой.

Как видно из данных таблицы 2, однократное введение крысам ССI 4 приводит к быстрому развитию токсического поражения их печени, при этом в контрольных группах крыс, по сравнению с интактными, статистически достоверно повышается содержание МДА в плазме на 36,9 %, снижаются ОАА и содержание метаболитов оксида азота на 58,5 и 76,4 % соответственно.

У крыс опытной группы, получающих хлеб с экстрактом, наблюдаются подобные изменения, но менее выраженные и практически не отличающиеся статистической достоверностью от таковых группы интактных животных, что показывает защитную роль нового компонента, добавленного в продукт.

Выводы . Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о профилактическом гепатопротекторном и антиоксидантном действии хлеба с экстрактом бурых водорослей, добавленного в рацион крыс с моделированным токсическим гепатитом.

Ингибирование процессов ПОЛ обеспечивается входящими в состав изучаемого водно-этанольного экстракта и хлеба с его добавлением, биологически активными соединениями, в том числе полифенолами, обладающими прямым радикалперехватыва-ющим действием и тем самым прерывающими свободнорадикальные реакции. Кроме этого, другие БАВ, входящие в состав испытуемого продукта, и прежде всего микроэлементы, хлорофилл, йод, фукоидан и др., оказывают опосредованное антиокис-лительное действие, выражающееся в способности защищать организм от окислительной деструкции.

Изучаемый водно-этанольный экстракт бурых водорослей обладает выраженной биологической активностью, что позволяет добавлять его в продукт в небольших количествах и сохранить традиционные органолептические свойства хлеба, что очень важно для потребителей, которые не всегда приветствуют посторонний вкус у хлеба и часто настаивают на повышении качества хлебобулочных изделий уже проверенного временем ассортимента [12]. В то же время такие количества данного экстракта не оказывают существенного влияния на технологические (органолептические и физико-химические) свойства хлеба. Сочетание этих свойств у водно-этанольного экстракта бурых водорослей является оптимальным и определяет дальнейшую перспективу его применения в качестве нового ингредиента гепатопротек-торного и антиоксидантного действия в продуктах профилактической направленности.