Оценка раздражающего и аллергизирующего действия инновационного пробиотического препарата при совместном использовании с гигиенической подстилкой

Введение. Скотоводство занимает одно из ведущих мест в структуре животноводства, обеспечивая население ценными продуктами питания. Молочная продукция пользуется у населения большим спросом, однако при современных условиях на первый план выходит не столько количество, сколько качество получаемого сырья. Возможность производства большого ассортимента молочнокислых продуктов прямо зависит от качества сырого молока, поступающего с животноводческих предприятий, поскольку не каждое сырье может быть пригодно для его переработки. Учитывая высокие требования, предъявляемые к качеству сырого молока и продуктам его переработки, первостепенной задачей становится создание оптимальных условий содержания лактирующих коров на животноводческих предприятиях [1].

Одним из ключевых вопросов гигиены содержания лактирующих коров является организация индивидуального места отдыха животного. Чистая и мягкая подстилка будет обеспечивать не только комфорт для коровы, но будет способствовать профилактике заболеваний вымени. Мастит остаётся одним из наиболее распространенных заболеваний в промышленном скотоводстве, наносящем животноводству значительный экономический ущерб, поэтому меры борьбы с ним должны носить комплексный характер и быть направ- лены на улучшение условий содержания животных и поддержания вымени в чистоте [2].

Одним из профилактических мер решения проблемы мастита является использование качественного подстилочного материала и обработка вымени экологически безопасными средствами, что даёт возможность содержать животное в чистоте и получать от него качественную продукцию [3, 4]. Согласно литературным данным применение различных средств для обработки вымени способствует снижению мастита на 10%, однако их эффективность зависит от состава [5].

Однако все используемые средства и препараты требуют всестороннего изучения и, в первую очередь, исследования на токсичность. Кроме того, следует учитывать, что искоренить заболеваемость маститом только за счёт применения дезинфицирующих средств невозможно – оптимальные результаты возможно достигнуть только при комплексном подходе, включающем как улучшение условий содержания животных, так и содержание вымени в чистоте.

Целью настоящей работы стало исследование токсичности на раздражающее и аллерги-зирующее действия пробиотического препарата и гигиенического подстилочного материала, как в виде одного средства, так и в комплексе, с дальнейшим их совместного использования при содержании лактирующих коров.

Условия, материалы и методы. Изучение местного раздражающего действия на слизистой оболочке глаз, а также раздражающего и аллергизирующего действия вещества при накожной аппликации пробиотического препарата и гигиенической подстилки материала, как в виде одного средства, так и в комплексе выполняли на опытных животных в условиях вивария кафедры технологии животноводства, кормления и зоогигиены ФГБОУ ВО Казанский ГАУ.

Гигиенический подстилочный материал разработан и выпускает ООО «Омега» для нужд промышленного животноводства, в частности скотоводства. Ее влагопоглощение составляет 700%, а влажность колеблется от 3 до 8%. Основу материала составляет древесная стружка толщиной 0,1-0,6 мм и длиной 2-5 мм, которую получают из высушенной древесины либо хвойных, либо лиственных пород, дополнительно вводят небольшое количество переработанных отходов деревообрабатывающей отрасли. Стружку пропускают через сита и магнитные уловители, благодаря чему она обеспылена и не содержит металлических включений. На финальном этапе материал фасуют в полиэтиленовую пленку и обеззараживают ионизирующим излучением. Плёнка поддерживает стерильность и защищает от загрязнения при перевозке и хранении.

Дополнительная обработка подстилки и ее облучение на завершающейся стадии обусловили необходимость токсикологических испытаний с целью оценки возможности применения подтилки для крупного рогатого скота.

Инновационное пробиотическое средство включает штаммы микроорганизмов Bacillus subtilis (штаммы В-14293), Bacillus amilolique-faciens (штаммы ЕМТ-В23 и В-14294) в концентрации 1×10¹⁰ КОЕ. Все штаммы депонированы в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции Промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт». Микроорганизмы рода Bacillus выделяют в окружающую их среду гидролизующие ферменты, которые обладают липазной, протеазной и амилолитической активностью, производят различные антибиотики и аминокислоты. Выделяя бактерицидные вещества и поглощая питательные вещества в окружающей их среде, они ингибируют рост и развитие таких патогенных микроорганизмов как например, E. coli, S. en-teridis, St. Аureus . Тем самым на поверхности кожи соска вымени, благодаря этим свойствам, патогенная микрофлора замещается на пробиотическую культуру [6].

Поскольку пробиотическое средств должно было применяться в комплексе с новой гигиенической подстилкой, в связи с этим, была поставлена задача их токсикологической оценки на лабораторных животных, с последующим совместным применением при содержании лактирующих коров с целью профилактики субклинического мастита.

Испытания, направленные на выявление местного раздражающего действия на слизи- стую оболочку глаза, а также раздражающего и аллергизирующего действия при накожной аппликации пробиотического средства и гигиенической подстилки, как в виде одного средства, так и в комплексе выполняли, руководствуясь Методическими указаниями «Оценка патогенности биотехнологических штаммов», утверждённых Роспотребнадзором 27.09.2024 и ОФС.1.7.2.0012.15 на кроликах породы Советская шиншилла.

Кормление и содержание животных, задействованных в эксперименте, организовывали в соответствии с утвержденным документом «Руководство по работе с лабораторными (экспериментальными) животными при проведении доклинических (неклинических) исследований» (Рекомендация Коллегии ЕЭК от 14.11.2023 № 33). Условия содержания животных в виварии отвечали общепринятым санитарно-гигиеническим требованиям, предъявляемых к помещениям для содержания лабораторных животных. Кормление кроликов проводили полнорационными гранулированными комбикормами. Вода из централизованных систем питьевого водоснабжения, отвечающая требованиям ГОСТ Р 71581-2024, предоставлялась без ограничения.

Опыты по оценке раздражающего действия на кожу выполняли на 24 кроликах, с живой массой 2,1-2,4 кг. За сутки до начала эксперимента на спине животных выстригали участки кожи размером 5×5 см справа и слева от позвоночника. Для предотвращения слизывания испытуемых веществ кроликам надевали пластиковые воротники. Животных разделили на три группы, по 8 особей обоего пола в каждой отобранных по принципу аналогов:

первая группа - на опытный участок кожи справа от позвоночника наносили пробиотическое средство, представляющее собой суспензию микробных клеток с концентрацией 1010 КОЕ/мл, в дозе 0,02 мл/см2, на контрольный участок слева наносили дистиллированную воду в том же объеме. Экспозиция составляла 4 часа, по завершении которых средство смывали теплой водой с мылом;

вторая группа - на опытный участок справа от позвоночника наносили гигиеническую подстилку, измельченную в лабораторной мельнице и смешанную с дистиллированной водой до состояния кашицы, в нативном виде из расчета 20 мг/см2, а контрольный участок слева увлажняли дистиллированной водой в объеме 0,02 мл/см2. Экспозиция составляла 4 часа, по завершении которых кашицу удаляли теплой водой с мылом;

третья группа - на опытный участок кожи справа от позвоночника наносили кашицу из гигиенической подстилки, измельченной в лабораторной мельнице и смешанную с пробиотиком (суспензия микробных клеток с концентрацией 1×1010 КОЕ/мл) в нативном виде из расчёта 20 мг/см2. Экспозиция длилась 4 часа, после чего кашицу удаляли теплой водой с мылом. После смывания реакцию кожи оценивали через 1, 3 и 18 часов, сравнении с сим- метричными участками кожи того же животного, где была нанесена дистиллированная вода. В дальнейшем за кроликами наблюдали ежедневно на протяжении 14 дней.

Эксперимент по определению аллергизиру-ющего действия изучаемых веществ при накожной аппликации пробиотика и гигиенической подстилки как в виде одного средства, так и в комплексе, проводили на 24 кроликах породы Советская шиншилла, живой массой 2,1-2,4 кг, разделенных на три группы по 8 особей обоего пола в каждой, отобранных по принципу аналогов. Методика формирования групп и нанесения средств на выстриженные участки кожи повторяла описанную выше, с той лишь разницей, что эксперимент длился 30 дней и испытуемые образцы пробиотического средства и гигиенической подстилки, либо их комплексного соединения наносили ежедневно. По завершении опыта за кроликами наблюдали ежедневно еще 14 дней.

При оценке раздражающего действия на слизистую оболочку глаз в опыт взяли 24 кролика породы Советская шиншилла с живой массой 2,1-2,4 кг. Для предотвращения повреждения глаз конечностями животным надевали пластиковые воротники. Перед началом опыта проводили обследование состояния поверхности глаза, чтобы не было каких-либо повреждений. Кроликов разделили на три группы по 8 особей обоего пола в каждой, отобранных по принципу аналогов:

первая группа – в конъюнктивальный мешок левого глаза вносили 2 капли нативного пробиотического средства (суспензия микробных клеток с концентрацией 1×1010 КОЕ/мл), а в правый глаз, служивший контролем, вносили 2 капли дистиллированной воды. После внесения пробиотического средства на 1 минуту прижимали слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза;

вторая группа – в конъюнктивальный мешок левого глаза вносили измельчённую нативную взвесь гигиенической подстилки в количестве 20 мг, правый глаз служил контролем, куда вносили 2 капли дистиллированной воды. После внесения измельченной гигиенической подстилки, на 1 минуту, прижимали слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза;

третья группа – в конъюнктивальный мешок левого глаза кроликов вносили влажную кашицу из 10 мг гигиенической подстилки, измельченной в лабораторной мельнице и смешанной с 2 каплями нативного пробиотического средства (суспензия микробных клеток с концентрацией 1×1010 КОЕ/мл), а в правый глаз, служивший контролем, вносили 2-3 капли дистиллированной воды. После внесения кашицы, слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза прижимали на 1 минуту.

Состояние слизистой оболочки и прозрачность роговицы подопытных кроликов оценивали через 1–3 часа после внесения, а далее ежедневно на протяжении 14 дней. Фиксировали появление, степень гиперемии и отека слизистой оболочки глаз, выделения в углу глаза, расширение и наполнение кровью склеры.

Результаты и обсуждение. До начала научно-исследовательских опытов по изучению местного раздражающего действия на слизистую оболочку глаза, а также раздражающего и аллергизирующего действия при накожной аппликации пробиотического средства и гигиенической подстилки, как в виде одного средства, так и в комплексе, подопытные животные проходили трехнедельный карантин.

Функциональное состояние кожи и степень выраженности раздражающего эффекта при нанесении на кожный покров кролика оценивали по интенсивности эритемы и величине отека, измеряемого по толщине кожной складки. В ходе наблюдений ни в одной из трех опытных групп не было зафиксировано функциональных нарушений кожных покровов, так эритема не возникала, отек по толщине кожной складки, сыпь, сухость кожи не регистрировались. Исходя из чего, наблюдаемый эффект по Методическим указаниям 4.2.4071-24. 4.2. был оценен в 1 балл. Участки кожи, обработанные испытуемыми образцами, не отличались от контрольных, на которые наносили дистиллированную воду.

Таким образом, по степени выраженности раздражающего воздействия, гигиеническую подстилку и инновационное пробиотическое средство, содержащее суспензию микробных клеток 10¹⁰ КОЕ/мл, как в виде одного средства, так и в совместном комплексе, можно причислить к веществам, не оказывающим раздражающее действие на кожу кроликов. Полученные данные согласуются с результатами И. В. Беловой и соавторов [7], которые при исследовании синбиотического препарата IV поколения «LB комплекс Л», в состав которого были включены пробиотические микроорганизмы рода Lactobacillus и Bifidobacterium , сделали заключение о его биобезопасности и как препарате не оказывающем местное раздражающее действие на кожные покровы лабораторных животных.

В результате опыта по определению аллер-гизирующего действия было установлено, что до 24-го дня поверхность кожи кроликов оставалась чистой, аллергических реакций после нанесения исследуемых веществ замечено не было и лишь с 24-го дня исследования наблюдались незначительные покраснения и сыпь, а также очень слабый и едва заметный отек по толщине кожной складки на поверхности кожи, которые исчезали на второй – третий день после окончания опыта (рис. 1-4). Наблюдаемый эффект был оценен в 1 балл.

Двухнедельное наблюдение за подопытными животными после завершения опыта токсических признаков не выявило. На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что пробиотический препарат и гигиенический подстилочный материал, как в чистом виде, так и в комплексе не вызывают аллергических реакций.

Рисунок 1 - Нанесение влажной кашицы из пробиотического препарата с гигиеническим подстилочным материалом на выстриженный участок кожи кролика.

Рисунок 2 - Оценка аллергизирующего действия пробиотического препарата совместно с гигиеническим подстилочным материалом (регистрация незначительного покраснения и сыпи, а также слабого, едва заметного отека по толщине кожной

Рисунок 3 - Внесение влажной кашицы из пробиотического препарата совместно с гигиеническим подстилочным материалом на слизистую оболочку глаза.

Рисунок 4 - Оценка раздражающего действия на слизистую оболочку глаз пробиотического препарата совместно с гигиеническим подстилочным материалом (отмечалось небольшое кровенаполнение сосудов склеры и незначительный отек глаз, а также минимальное количество выделений в углу глазной щели, которые исчезали через 1-3 часа наблюдения).

При экспериментах по определению раздражающего действия исследуемых веществ на слизистую оболочку глаз у кроликов второй и третьей групп отмечалось небольшое кровенаполнение сосудов склеры и незначительный отек глаз, а также минимальное количество выделений в углу глазной щели, которые исчезали через 1-3 часа наблюдения. У кроликов первой группы, которым в конъюнктивальный мешок левого глаза вносили нативное пробиотическое средство, не было зафиксировано каких-либо явных отклонений, так гиперемии и отека глаз, помутнения роговицы глаза, радужной оболочки, а также выделений в углу глазной щели замечено не было. Полученные данные согласуются с научноисследовательской работой Р. С. Мухаммади-ева с соавторами [8, 9], которые при исследовании пробиотического препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов не выявили раздражения коньюк-тивы глаза. В свою очередь, древесная под- стилка при нанесении на слизистую оболочку глаз кроликов вызывала лишь слабо выраженную гиперемию, которая проходила в течение 1-1,5 часа [10]. Совместное применение пробиотического средства и древесной подстилки до настоящего времени не изучалось.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать заключение, что комплексное использование инновационного пробиотического средства и гигиенической подстилки не вызывает раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.

Выводы. Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что комплексное применение инновационного пробиотического средства и гигиенической подстилки не оказывает раздражающее действие на кожные покровы и слизистые оболочки глаз и не обладает аллер-гизирующим эффектом. На основании этого, их можно рекомендовать для использования в практике при содержании лактирующих коров.