Оценка риска формирования у детей вторичного иммунодефицита в условиях контаминации биосред алюминием и полиморфизма гена клеточной гибели FAS RS1159120 и антигенраспознающего гена толл-подобного рецептора TLR4 rs1927911

Долгих Олег Владимирович – доктор медицинских наук, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Зайцева Нина Владимировна – академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель (e-mail: ; тел.: 8 (342) 237-25-34; ORCID: .

Казакова Ольга Алексеевна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник-заведующий лабораторией иммуногенетики (e-mail: ; тел.: 8 (922) 646-56-87; ORCID: .

Ярома Алеся Вячеславовна – младший научный сотрудник лаборатории клеточных методов диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (919) 499-66-41; ORCID: .

Ганич Татьяна Сергеевна – младший научный сотрудник лаборатории иммуногенетики (e-mail: ; тел.: 8 (952) 318-57-45; ORCID: .

Одной из задач профилактики развития хронических интоксикаций является выявление дисбаланса микроэлементов, в том числе таких, как алюминий. В организме человека алюминий не несет никакой биологической функции, однако продолжительное пребывание в биосредах элемента и его соединений может негативно повлиять на кроветворную систему, скелет, нервную систему и иммунологические пока-затели¹ [1, 2]. Этот металл негативно влияет не только на структуру клетки, но и на ее функционал, в частности, способность к пролиферации [3]. Алюминий способен активизировать экспрессию гена апоптоза – FAS [4]. D. Cheng et al. выявили и доказали, что алюминий повреждает макрофаги, что способствует развитию вторичного иммунодефицита [1, 5]. По экспериментальным данным B. Wang et al. выявлено, что алюминий также влияет на микрофлору кишечника, снижая ее разнообразие, и способствует изменению общей структуры сообщества кишечной микробиоты, что отражается на состоянии иммунной системы [6].

Среди типов дисфункций иммунной системы особое место занимает вторичный (приобретенный) иммунодефицит, который может встречаться в различных возрастных группах. В возрасте 4–6 лет дети подвергаются повышенной вирусной и бактериальной нагрузке, а нарушение дифференцировки, пролиферации и адаптации клеток вместе со снижением их числа и активности приводит к частой простудной заболеваемости с возможными бактериальными осложнениями [7].

Несмотря на то, что вторичный иммунодефицит не является врожденным, тем не менее полиморфизм генов, регулирующих иммунный ответ, имеет немаловажное значение для формирования устойчивости организма к воздействию химических и биологических факторов среды обитания.

Рецепторы семейства толл-подобных рецепторов TLR относятся к системе врожденного иммунитета и первыми распознают лиганды вирусов, бактерий, простейших, грибов и запускают иммунную реакцию [8]. Существуют свидетельства, что полиморфизм генов TLR, в частности TLR4, который представляет собой сигнальную молекулу, регулирующую экспрессию цитокинов, связан с аллергическими, инфекционными и аутоимунными заболеваниями [9, 10].

Система FAS-опосредованного апоптоза (CD95+) контролирует физиологические и патологические клеточные процессы дифференцировки и гибели. Исследование мутаций в гене FAS может способствовать пониманию патогенеза аутоиммунных заболеваний и формирования иммунодефицита [11]. Антиген FAS играет центральную роль в регуляции запрограммированной гибели клеток и экс- прессируется на поверхности В- и Т-лимфоцитов [12, 13].

Поиск новых иммунологических и генетических маркеров, ассоциированных с риском развития у детей вторичного иммунодефицита, модифицированного алюминием, является актуальным в свете новых угроз и вызовов, продиктованных изменением санитарно-гигиенической ситуации в связи с аэрогенным поступлением новых токсикантов, формирующих негативные эффекты для здоровья.

Цель исследования – оценить риск формирования вторичного иммунодефицита, ассоциированного с особенностями полиморфизма гена клеточной гибели FAS rs1159120 и гена антигенраспознающего толл-подобного рецептора TLR4 rs1927911 у детей в условиях контаминации биосред алюминием.

Материалы и методы. В исследовании приняли участие 97 детей в возрасте от 3 до 6 лет, проживающих в зоне влияния выбросов комбината цветной металлургии Западной Сибири. Группа наблюдения включала 50 человек в возрасте 5,0 ± 0,3 г. с вторичным иммунодефицитным состоянием (общий вариабельный иммунодефицит, D83), группа сравнения включала 47 условно здоровых детей в возрасте 4,3 ± 0,3 г. Группы сопоставимы по возрасту, материальному статусу и этнической принадлежности.

Все обследования проводились на базе ФБУН «ФНЦ МРТ УРЗН» (одобрено этическим комитетом, протокол № 8 от 17.07.2023) с соблюдением этических норм, изложенных в Хельсинкской декларации ВМА.

Количественное определение алюминия в моче осуществлялось на квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500cx (Agilent Technologies, USA) с октопольной реакцион-но/столкновительной ячейкой (ORS) в соответствии с МУК 4.1.3589-19 «Измерение массовой концентрации алюминия в биологических средах (кровь, моча) методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой».

Иммунологические исследования показателей сыворотки крови осуществлялись унифицированным методом исследования – иммуноферментным анализом крови на приборе Biotek ELx808 (США).

Было выполнено исследование CD-кластеров дифференцировки клеток и внутриклеточных маркеров системы апоптоза на проточном цитометре BD FACSCalibur (США) с использованием соответствующих моноклональных антител с помощью универсальной программы CellQuestPrO. Исследование включало определение количества CD127-, CD16+56+, CD19+, CD3+, CD3+ CD8+ методом проточной цитометрии.

Показатели фагоцитарной активности определялись с использованием в качестве объектов фаго- цитоза формалинизированных эритроцитов барана методом В.Н. Каплина.

У всех обследуемых был изучен полиморфизм гена клеточной гибели FAS rs1159120 и антигенрас-познающего гена толл-подобного рецептора TLR4 rs1927911 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на приборе CFX96 Real Time System.

Обработка данных осуществлялась с помощью программ Statistica 12.0 (StatSoft, Inc., США) и Microsoft Excel 2013. Определяли среднее значение ( Х ) и его стандартное отклонение ( SD ). Нормальность распределения оценивали критерием Шапиро – Уилка. Сравнение средних осуществлялось t -методом Стьюдента. Для оценки зависимости исследуемых иммунных маркеров от уровня контаминации биосред алюминием использовался корреляционный метод Пирсона. Оценка риска проводились с использованием расчета показателя относительного риска развития негативных процессов, ассоциированных с полиморфизмом кандидатных генов ( RR ). При уровне значимости более 95 % ( р < 0,05) отличия считали достоверными.

Результаты и их обсуждение. По результатам химического анализа установлено, что у детей группы наблюдения относительно группы сравнения отмечается достоверно повышенный уровень алюминия в моче в 1,8 раза (0,0095 ± 0,0014 против 0,0054 ± 0,0009 мг/дм³, референтный диапазон < 0,0075мг/дм³).

Установлено, что у детей группы наблюдения достоверно повышен специфический иммунный ответ по критерию IgG к алюминию в 1,8 раза ( p < 0,05) относительно данных группы сравнения [14].

Сравнительный анализ кластеров клеточной дифференцировки в анализируемых группах позволил выявить достоверный дисбаланс регуляторных медиаторов в группе наблюдения, ассоциированных с иммунодефицитом: снижение абсолютного уровня Т-зрелых CD3+-лимфоцитов, отвечающих за клеточный иммунитет (в 1,4 раза). Показана достоверная обратная зависимость уровня CD3+ от уровня контаминации биосред (моча) алюминием (r = -0,38; p < 0,05). Н.А. Алпатова и соавт. в своих исследованиях отмечают снижение доли CD3+-лимфоцитов в группе животных, получавших алюминий2 [15]; установлен дефицит Т-хелперов CD3+CD4+ (в 1,3 раза), отвечающих за распознавание антигенов и регуляцию иммунного ответа, а также выявлена достоверная обратная зависимость с контаминацией биосред (моча) алюминием (r = -0,39). В других исследованиях команда Y. She et al. отмечают снижение активности иммуноцитов Th1, секретирующих провоспалитель- ные цитокины в условиях экспозиции алюминием [16]. В нашем исследовании показано, что дефицит эффекторных Т-цитотоксических лимфоцитов CD3+ CD8+ (в 1,4 раза) приводит к отмене запуска апоптоза, что связано с негативными эффектами алюминия на клеточный иммунитет (r = -0,26; p < 0,05) [16, 17]. Настоящим исследованием верифицировано угнетение продукции (в 3,1 раза) Т-регуляторных лимфоцитов CD127-, а также достоверное снижение экспрессии пускового фактора апоптоза – мембранного рецептора клеточной гибели FAS-рецептора – CD95+ (в 1,6–1,8 раза), контролирующих напряженность иммунного ответа T-эффекторных клеток [18]; достоверное угнетение экспрессии Toll-подобного рецептора 4 (CD284+ отн./абс. в 1,6–1,8 раза), что отменяет адекватные провоспалительные медиаторные эффекты противовирусного и противобактериального иммунитета относительно аналогичных показателей у детей группы сравнения (p < 0,05).

Оценка фагоцитарной активности показала, что группа наблюдения отличается низким относительным числом фагоцитирующих клеток и их поглотительной способности на 10 % относительно данных группы сравнения (табл. 1), при этом повышение концентрации алюминия в биосредах (моча) имеет обратную зависимость от уровня фагоцитарной активности, что верифицирует его иммуносупрессивные свойства3 [19, 20].

Результаты изучения особенностей полиморфизма генов рецептора клеточной гибели FAS (rs1159120) и толл-подобного рецептора TLR4 (rs1927911) у детей с иммунодефицитом, экспонированных алюминием, позволили выявить значимое ( р < 0,05) повышение частоты аллеля С гена FAS (rs1159120) и генотипа СС в 1,2 и 1,5 раза соответственно, а также значимое ( р < 0,05) повышение частоты аллеля G гена TLR4 (rs1927911) в 1,8 раза соответственно относительно данных группы сравнения. Дикий аллель С гена FAS (rs1159120) и минорный аллель G гена TLR4 (rs1927911) выступают в качестве факторов, увеличивающих вероятность наступления нежелательных сценариев (вероятность проявлений иммунодефицитного состояния), ассоциированных с контаминацией биосред (моча) алюминием ( OR = 4,05; CI : 1,41–11,59; p = 0,006; RR = 1,23; CI : 1,02–1,48 ) и ( OR = 2,01; CI : 1,04–3,91; p = 0,037; RR = 1,64; CI : 1,46–1,94 ) (табл. 2). При этом абсолютный уровень экспрессии CD3+CD95+ активированных Т-лимфоцитов и CD284+ как маркеров апоптоза, экспрессии цитокинов и эффективности противоинфекционного иммунитета при данных полиморфизмах гена FAS (rs1159120) и гена толл-подобного рецептора TLR4

Таблица 1

Особенности иммунного профиля детей обследуемых групп

Показатель	Референтный диапазон	Наблюдение	Сравнение	p (t)
IgG к алюминию, усл. ед.	0–0,1	0,16 ± 0,05	0,09 ± 0,02	0,0220
CD3+-лимфоциты, абс, 109 л	0,69–2,54	1,54 ± 0,13	2,08 ± 0,24	0,0000
CD3+CD4+-лимфоциты, абс., 109 л	0,41–1,59	0,84 ± 0,08	1,10 ± 0,13	0,0010
CD3+CD8+-лимфоциты, абс., 109 л	0,19–1,14	0,60 ± 0,07	0,83 ± 0,09	0,0000
CD127- лимфоциты, абс, 109 дм3	0,015–0,04	0,07 ± 0,03	0,22 ± 0,05	0,0000
CD95+ лимфоциты, абс, 109 дм3	0,43–0,87	0,290 ± 0,04	0,511 ± 0,05	0,0008
CD95+ лимфоциты, отн, %	20–40	15 ± 1,05	25 ± 2,15	0,0000
CD284+ лимфоциты, абс, 109 дм3	0,2–0,4	0,208 ± 0,03	0,380 ± 0,04	0,0008
CD284+ лимфоциты, отн, %	10–20	11 ± 0,95	18 ± 0,97	0,0000
Процент фагоцитоза, %	35–60	48,44 ± 1,98	53,76 ± 3,16	0,0060
Фагоцитарное число, усл. ед.	0,8–1,2	0,88 ± 0,05	1,02 ± 0,08	0,0070
Абсолютный фагоцитоз, 109 дм3	1–2	1,24 ± 0,13	1,93 ± 0,31	0,0000

Таблица 2

Результаты генотипирования кандидатных генов FAS (rs1159120) и TLR4 (rs1927911)

Ген Аллель Наблюдение % (N) Сравнение % (N) χ2 (p) OR (CI) Генотип Наблюдение % (N) Сравнение % (N) χ2 (p) OR (CI) FAS C14405T (rs1159120) C 92,4 (85) 75,0 (30) 7,52 (0,006) 4,05 (1,41–11,59) CC 84,8 (39) 55,0 (11) 7,70 (0,02) 4,56 (1,38–15,03) CT 15,2 (7) 40,0 (8) 0,27 (0,08–0,90) T 7,6 (7) 25,0 (10) 0,25 (0,09–0,71) TT 0 (0) 5,0 (1) 0,14 (0,01–3,58) TLR4 A8595G (rs1927911) A 72,9 (70) 84,4 (103) 4,34 (0,037) 0,50 (0,26–0,97) AA 58,3 (28) 73,8 (45) 3,50 (0,17) 0,50 (0,22–1,12) AG 29,2 (14) 21,3 (13) 1,52 (0,63–3,64) G 27,1 (26) 15,6 (19) 2,01 (1,04–3,91) GG 12,5 (6) 4,9 (3) 2,76 (0,65–11,68) отличался достоверным снижением экспрессии данных фенотипов в группе наблюдения в 1,6–1,8 раза, отражая прогнозируемое угнетение клеточной гибели и контроллинга элиминации протеинов как инфекционных агентов, так и собственных нефункциональных белков (табл. 2).

Таким образом, настоящим исследованием верифицирована гипотеза, подтверждающая результаты ранее проведенных исследований эффектов алюминия in vitro как иммуносупрессора, действующего на ряд приоритетных регуляторных кластеров клеточной дифференцировки, а именно на фенотипы Т-зрелых лимфоцитов, включая Т-хелперы, эффекторные клетки, Т-регуляторные лимфоциты, в том числе обладающие рецепторами контроллинга апоптоза и цитокиновой регуляции (CD284⁺; CD95⁺), дисбаланс которых достоверно сопряжен с измененной частотой риск-ассоциированных аллелей генов врожденного и адаптивного иммунитета TLR4 A8595G (rs1927911) и FAS C14405T (rs1159120) у детей с установленным диагнозом вторичного иммунодефицита в условиях контаминации биосред алюминием ( RR = 1,23–1,64).

Выводы. Показано, что в условиях полиморфизма гена клеточной гибели FAS rs1159120 и гена антигенраспознающего толл-подобного рецептора TLR4 rs1927911 у детей с избыточным содержанием алюминия в биологических средах (превышение референтного уровня в 1,3 раза) формируется риск ( RR = 1,23–1,63) развития вторичного иммунодефицитного состояния.

Настоящим исследованием показаны иммуносупрессивные эффекты алюминия на клетки иммунной системы (Т-регуляторные лимфоциты CD127^-, Т-лимфоциты с фенотипом CD95⁺ – снижение продукции в 1,6–3,1 раза, CD284⁺ фенотип толл-подоб-ных рецепторов в 1,6–1,8 раза), верифицированные достоверными моделями зависимости угнетения экспрессии Т-лимфоцитарных кластеров, ассоциированных с содержанием алюминия в моче (CD3⁺: r = -0,38; CD4⁺: r = -0,39; CD8⁺: r = -0,26), что проявляется в виде отмены контроллинга апоптоза, угнетения активации его рецептор-опосредо-ванного пути и противоинфекционного иммунитета (CD284⁺; CD95⁺).

Установлена достоверно повышенная распространенность кандидатных аллелей и генотипов генов врожденного и адаптивного иммунитета – аллеля С и генотипа СС гена FAS (rs1159120) в 1,2 и 1,5 раза соответственно, а также минорного аллеля G гена TLR4 (rs1927911) в 1,8 раза относительно группы сравнения, ассоциированная с контаминацией биосред (моча) алюминием (OR = 4,05; CI: 1,41–11,59; p = 0,006; RR = 1,23; CI: 1,02–1,48) и (OR = 2,01; CI: 1,04–3,91; p = 0,037; RR = 1,64; CI: 1,46–1,94), что снижает устойчивость организма к биологическим факторам среды обитания вирусного и бактериального происхождения (CD284+) и формирует риск развития вторичного иммунодефицитного состояния (D83).

Рекомендуется использовать иммунологические (CD284⁺; CD95⁺) и генетические (аллель С и генотип СС гена FAS (rs1159120) и аллель G гена TLR4 (rs1927911)) показатели в качестве маркеров эффекта и чувствительности, ассоциированных с риском ( RR = 1,23–1,64) развития у детей вторичного иммунодефицита, модифицированного алюминием.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.