Оценка риска неблагоприятного течения язвенного колита с использованием определения полиморфизма гена фактора некроза опухоли альфа

Язвенный колит (ЯК) – хроническое заболевание толстой кишки, характеризующееся иммунным воспалением ее слизистой оболочки, обычно без гранулем при биопсии [1, 2]. Актуальность проблемы диагностики, лечения и профилактики ЯК на сегодня не подлежит сомнению. Это подтверждается отсутствием полных данных об этиологии болезни, ростом заболеваемости среди лиц трудоспособного возраста, рецидивирующим течением, развитием угрожающих жизни осложнений, необходимостью проведения длительной, часто пожизненной, дорогостоящей терапии и неблагоприятным медикосоциальным прогнозом [3–5].

Одним из ведущих механизмов в развитии и прогрессировании ЯК является иммуновоспалительный процесс с дисбалансом цитокинов [6, 7]. Фактор нек-

Третьякова Юлия Игоревна – кандидат медицинских наук, доцент кафедры поликлинической терапии (e-mail: ; тел.: 8 (342) 217-10-31; ORCID: .

Щекотова Алевтина Павловна – доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 217-10-31; ORCID: .

Булатова Ирина Анатольевна – доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 217-10-31; ORCID: .

Кривцов Александр Владимирович – кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией иммуногенетики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-86-99; ORCID: .

роза опухоли альфа (TNF-α) – самый мощный про-воспалительный цитокин, который участвует в патогенезе ЯК [8]. Он продуцируется макрофагами в толстой кишке и может непосредственно повреждать ее слизистый барьер, вызывая воспалительные изменения [9, 10]. Одним из самых мощных индукторов TNF-α считают бактериальные липополисахариды, которые при ЯК находятся в просвете толстой кишки в большом количестве. Проведенные исследования показали, что у 77,8 % больных ЯК в период обострения в слизистой оболочке толстой кишки уровень TNF-α повышается [11].

ЯК относится к болезням с генетически гетерогенной комплексной предрасположенностью [12]. В последние годы выполнено большое число работ, выявивших ассоциации между вариантами аллелей генов регуляторных молекул воспаления, характером продукции соответствующих белков и предрасположенностью к тем или иным заболеваниям. Знание их роли в патогенезе многих заболеваний позволяет, с одной стороны, прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее протекания, с другой стороны, подобрать специфическую терапию для конкретного пациента [13]. Активно ведется поиск генов предрасположенности к ЯК [14]. При исследовании полиморфизма гена TNF- α у пациентов с ЯК в сравнении со здоровыми лицами самые высокие статистически значимые изменения наблюдались в положении –308 G/A [15, 16]. По данным F. Wang et al. [17] статистически значимых различий в частоте аллельных вариаций гена TNF- α-308 G/A между больными ЯК и здоровыми не было обнаружено ни у европейцев, ни у азиатов. Однако было выявлено превалирование генотипа GA и GA + AA над GG у азиатов. По другим данным частота генотипов и аллелей А и G гена TNF- α (-G308A) в группе пациентов с ЯК не отличалась от популяционной [18, 19].

Таким образом, данные литературы, оценивающие вклад полиморфизма гена TNF- α-308 G/A в прогрессирование иммунного воспаления в толстой кишке при ЯК, противоречивы. Недостаточно сведений о взаимосвязи полиморфизма данного гена со степенью тяжести атаки ЯК и эндоскопическими изменениями, что определило направленность нашего исследования.

Цель исследования – оценить функциональную значимость полиморфизма гена TNF- α в регионе -308G/A (rs1800629) в прогрессировании ЯК (на примере больных в Пермском крае).

Материалы и методы. Обследовано 70 больных ЯК в фазе активного воспаления. Средний возраст составил 36,21 ± 11,69 г., 34 мужчины и 36 женщин (48 и 52 % соответственно). Продолжительность заболевания в среднем составила 7,24 ± 6,56 г. Пациенты обследованы на базе отделений гастроэнтерологии и хирургии клинической медико-санитар- ной части № 1, городской клинической больницы № 2 (г. Пермь). Диагноз ЯК устанавливали на основании клинических рекомендаций по диагностике и лечению пациентов с ЯК [1]. Оценивали степень эндоскопической активности (ЭА) и индексы клинической и эндоскопической активности (ИКА и ИЭА). Контрольная группа состояла из 50 практически здоровых лиц, группа была сопоставима по возрасту и полу с последующей группой.

Концентрацию TNF-α в сыворотке крови обследуемых лиц измеряли методом иммунофермент-ного анализа (ИФА) с использованием одноименных наборов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) и регистрацией результатов на фотометре Stat-Fax 2100 (США). Для выявления однонуклеотидных полиморфизмов гена TNF- α в регионе -308G/A у пациентов с ЯК и здоровых доноров методом ПЦР-РВ суммарную ДНК выделяли из образцов цельной венозной крови, предварительно стабилизированной этилен-диаминтетрауксусной кислотой, используя набор «ДНК-Сорб-В» (ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва). Исследование полиморфизма -308G/A гена TNF- α проводили на амплификаторе Real-time CFХ-96 (BioRad Laboratories, Inc., США) с использованием аллель-специфической ПЦР «SNP-Скрин» (ЗАО «Синтол», г. Москва) и детекцией продуктов в режиме реального времени.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft). Для описания полученных количественных признаков данные представляли в виде медианы ( Ме ) и 25-го и 75-го перцентиля. Для оценки значимости различий независимых групп использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Количественную оценку линейной связи выполняли с использованием коэффициента корреляции по Спирмену ( r ). Для описания соотношения частот генотипов и аллелей исследуемых генов использовали метод χ². Отношение шансов ( OR ) определяли как отношение вероятности того, что событие произойдет, к вероятности того, что событие не произойдет. Определение зависимости между изучаемыми качественными признаками осуществляли по таблице сопряженности (кросстабуляции)¹. Сила связи признаков измерялась коэффициентом сопряженности (информативности) Пирсона ( K i ). Различия между выборками считали достоверными при значении для р <0,05.

Результаты и их обсуждение. Выявлено значимое повышение концентрации фактора TNF-α в сыворотке крови у пациентов с ЯК в активную стадию заболевания по сравнению с практически здоровыми лицами (3,38 (0,85–4,90) и 0,00 (0,00–0,00) пг/мл соответственно; р = 0,02), что согласуется с литературными данными [6, 9, 11]. У 86,2 % (62 че- ловека) был повышен средний показатель данного фактора по сравнению с референсными значениями. Таким образом, у большей части больных ЯК в период атаки заболевания содержание провос-палительного цитокина TNF-α в сыворотке крови в несколько раз превышало референсные значения, что подтверждает наличие при данной нозологии выраженного иммуновоспалительного компонента.

При корреляционном анализе выявлена значимая высокая прямая взаимосвязь между уровнем TNF-α в сыворотке крови и степенью тяжести атаки ЯК ( r = 0,77; р = 0,000), ИКА ( r = 0,4; р = 0,04), ИЭА ( r = 0,31; р = 0,01) и протяженностью эрозивноязвенного процесса в толстой кишке ( r = 0,3; р = 0,04). То есть TNF-α адекватно оценивает степень и распространенность воспаления в толстой кишке. Оценка сывороточного уровня TNF-α может быть использована для стратификации тяжести атаки ЯК, определения степеней эндоскопической активности и обсуждения вопросов коррекции терапии, что подтверждает данные некоторых исследователей [8, 10, 11].

При изучении распространенности генотипов и аллелей полиморфизма гена TNF- α в позиции rs1800629 у пациентов с ЯК и здоровых лиц в Пермском крае преобладал генотип GG (рис. 1).

Рис. 1. Частота обнаружения аллельных вариантов гена TNF- α-308G/A (rs1800629) в анализируемых когортах здоровых и больных ЯК. По оси ординат: количество больных, выраженное в процентах. По оси абсцисс: генотипы и аллели гена TNF- α (rs1800629)

Не было отмечено достоверных различий в частоте встречаемости протективного аллеля G (76,43 и 81,48 % соответственно; χ² = 1,16; р = 0,28; OR = 0,74) и минорного аллеля А (23,57 и 18,52 % соответственно; χ² = 1,16; р = 0,28; OR = 1,36) гена TNF- α в регионе -308G/A в исследуемых группах, что согласуется с данными других исследователей [17, 18]. Однако неблагоприятная гомозигота АА значимо чаще обнаруживалась у пациентов с ЯК, чем в популяции доноров (5,71 и 1,23 % соответственно; χ² = 2,35; р = 0,04; OR = 4,85) (см. рис. 1). Таким образом, носительство гомозиготы АА гена TNF- α (rs1800629) может рассматриваться как маркер генетической предрасположенности к ЯК.

Для сравнительного анализа уровня фактора TNF-α и для оценки функциональной значимости полиморфизма гена TNF- α в регионе -308G/A в прогрессировании ЯК больные были разделены на две подгруппы с учетом степени тяжести атаки (СТА) и степени ЭА по данным ректороманоскопии (РРС) и фиброколоноскопии (КФС). В I подгруппу ( n = 37) были включены пациенты с ЯК с легкой и среднетяжелой атакой с редкими рецидивами заболевания и 1–2-й степенью ЭА. Во II подгруппу ( n = 33) вошли больные с тяжелым непрерывным и часто рецидивирующим течением ЯК и 3–4-й степенью ЭА.

Уровни TNF-α у больных ЯК с 3–4-й степенью ЭА достоверно превышали значения, полученные у лиц с ЭА 1–2-й степени ( р = 0,0000) (таблица). Оценка сывороточного уровня TNF-α у больных ЯК может быть информативна для определения степеней ЭА и обсуждения вопросов коррекции терапии.

При оценке встречаемости аллельных вариаций гена TNF- α-308G/A (rs1800629) при разной эндоскопической активности ЯК мажорный аллель G и аллельная пара GG значимо чаще обнаруживались в группе пациентов с легкой и среднетяжелой атакой и 1–2-й степенью ЭА, чем в группе с 3–4-й степенью ЭА и тяжелой атакой ЯК (χ² = 14,19; p = 0,000; OR = 6,34). Минорный или мутантный аллель А, напротив, значимо чаще встречался в группе больных с 3–4-й степенью ЭА и тяжелой атакой ЯК – в 37,88 % (χ² = 14,19; р = 0,000; ОR = 0,20).

Уровень фактора TNF-α и частота встречаемости аллельных вариантов гена TNF-α в регионе -308G/A (rs1800629) у пациентов с ЯК в зависимости от степени тяжести атаки (СТА) и степени ЭА

Фактор/генотип/аллели		ЯК, n = 70		ОR (95 % CI )	р
		Степень тяжести атаки (1–2) и ЭА I–II ст.; ( n = 37); % ± m	Степень тяжести атаки (3) и ЭА III–IV ст.; ( n = 33); % ± m
TNF-α, пг/мл		0,90 (0,20–2,55)	8,70 (7,10–12,00)	–	0,0000
TNF-α - 308G/A	GG, %	78,38 ± 6,77	36,36 ± 8,37	6,34 (2,21–18,24)	0,001
	GА, %	21,62 ± 6,77	51,52 ± 8,7	0,26 (0,09–0,73)	0,001
	АА, %	0 ± 0	12,12 ± 5,68	0,0 (0,00–0,00)	0,001
Аллели	G-аллель, %	89,19 ± 3,61	62,12 ± 5,97	5,03 (12,07–12,21)	0,000
	А-аллель, %	10,81 ± 3,61	37,88 ± 5,97	0,20 (0,08–0,48)	0,000

П р и м е ч а н и е : TNF-a - фактор некроза опухоли альфа; OR - отношение шансов, 95 % CI - доверительный интервал (ДИ) для OR , р – значимость различий; СТА (1,2,3) и ЭА (I, II, III, IV) – степени тяжести атаки и эндоскопической активности.

Рис. 2. Частота обнаружения аллельных вариантов гена TNF-α -308G/A (rs1800629) у больных ЯК при разной тяжести атаки и степени ЭА. По оси ординат: количество больных, выраженное в процентах. По оси абсцисс: генотипы и аллели гена TNF-α (rs1800629)

Неблагоприятная гомозигота АА была найдена у 12,12 % больных ЯК с высокой ЭА и не встречалась у пациентов с низкой и умеренной степенью ЭА (χ² = 14,11; р = 0,001; ОR = 0,00) (рис. 2). Следовательно, наличие мутантного аллеля А и гомозиготы АА гена TNF- α-308G/A является предиктором тяжелого рецидивирующего течения ЯК со склонностью к прогрессированию.

При определении зависимости между изучаемыми качественными признаками по таблице сопряженности (кросстабуляции) в группе больных ЯК была установлена выраженная ассоциация полиморфизма промоторного региона -308G/A гена TNF- α с увеличением выработки одноименного фактора TNF-α, степенью тяжести атаки ( K i = 0,75; р = 0,000 и K i = 0,84; р = 0,000 соответственно), с индексами клинической и эндоскопической активности ( K_i = 0,85; р = 0,000 и K_i = 0,78; р = 0,000 соответственно) и с протяженностью поражения в толстой кишке по данным эндоскопии ( K i = 0,89; р = 0,000). Также выявлена высокая зависимость с уровнем С-реактивного белка ( K i = 0,73; р = 0,000), лейкоцитов крови ( K i = 0,59; р = 0,000), скорости оседания эритроцитов ( K i = 0,67; р = 0,000) и α 1 , α 2 и γ-глобулинов ( K i = 0,46; р = 0,017; K i = 0,72; р = 0,000; K i = 0,61; р = 0,000), являющихся лабораторными маркерами острой фазы воспаления, и с количеством альбумина в крови ( K_i = 0,73; р = 0,000).

Таким образом, установленная ассоциация полиморфизма промоторного региона -308G/A гена TNF-α с повышенной экспрессией фактора TNF-α в крови у больных ЯК может вносить вклад в активацию иммуновоспалительного синдрома в группе носителей; наши результаты подтверждают данные других исследователей [11–13]. Выявленная взаимосвязь полиморфизма данного гена со степенью тяжести атаки ЯК, ИЭА, острофазовыми показателями крови, а также наличие мутантного аллеля А и гомозиготы АА у больных с высокой степенью ЭА и тяжелыми обострениями может свидетельствовать о вкладе полимор- физма гена TNF-α в предрасположенность к неблагоприятному течению ЯК. Предполагаемый нами фактор риска тяжелого течения ЯК является значимым (у гомозигот по нормальному аллелю прогнозируется более легкое течение болезни) – OR 6,34 (ДИ 2,21–18,24).

Предлагается проведение профилактического обследования для выявления значимого полиморфного аллеля гена TNF- α в позиции -308G/A ( OR 5,03; ДИ12,07–12,21) с целью формирования дополнительных программ обследования и лечения больных ЯК, так как наличие мутантного аллеля в пять раз повышает риск пациента к более тяжелому течению болезни.

Выводы . У больных ЯК в период активного воспаления выявлен высокий уровень TNF-α в крови по сравнению с контрольной группой. При этом концентрация данного цитокина была значимо выше у пациентов с тяжелым течением и частыми рецидивами болезни и высокой степенью ЭА, что может быть использовано для стратификации степени тяжести атаки ЯК и определения степеней ЭА.

При распределении генотипов и аллелей региона -308G/A гена TNF- α в позиции rs1800629 у пациентов с ЯК и здоровых лиц в Пермском крае преобладал генотип GG. Не было отмечено статистически значимых различий в частоте встречаемости протективного аллеля G и минорного аллеля А в сравниваемых группах. Тем не менее неблагоприятная гомозигота АА значимо чаще обнаруживалась у пациентов с ЯК, чем в популяции доноров. Можно предполагать, что носительство данной гомозиготы свидетельствует о генетической предрасположенности к ЯК.

Кроме того, при оценке встречаемости аллельных вариаций гена TNF- α при разной степени тяжести и эндоскопической активности ЯК установлены мутантный аллель А и неблагоприятная гомозигота АА, ассоциированные с тяжелым прогрессирующим течением ЯК.

Следовательно, риск развития неблагоприятного течения ЯК, склонного к частым рецидивам и прогрессированию, ассоциирован с носительством мутантного аллеля А гена TNF- α-308G/A. В связи с этим при постановке первичного диагноза ЯК может быть рекомендовано генетическое исследование с определением полиморфизма гена TNF- α - 308G/A для оценки риска неблагоприятного течения и определения индивидуальных лечебных и профилактических мероприятий.

Финансирование. Исследование проводится в рамках государственного задания и относится к комплексной теме № 115030310053.