Оценка риска никельсодержащих наноматериалов: характеристика опасности in vivo

Гмошинский Иван Всеволодович – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий (e-mail: ; тел.: 8 (495) 698-53-71; ORCID: .

Хотимченко Сергей Анатольевич – член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий (e-mail: ; тел.: 8 (495) 698-52-35; ORCID: .

Введение в дыхательные пути. Интратрахе-альные и орофарингеальные инстилляции наноматериалов часто применяются в токсикологических исследованиях как модель респираторной экспозиции. По сравнению с ингаляционным путем введения они позволяют более точно учитывать дозу наноматериала, получаемого каждым животным, хотя и имеются особенности в распределении в дыхательных путях частиц различного размера и химического состава при этих альтернативных путях экспонирования. При этом используются как острая, так и различные подострые схемы экспозиции.

В раннем исследовании [11] НЧ NiO размером 8 нм, агрегированные в кластеры 26 нм, вводили самцам крыс Wistar однократно интратрахеально в дозе 0,33–0,66 мг/кг. В бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), начиная с третьих суток опыта, выявлено повышение содержания индуцированных цитокинами хемоаттрактантов нейтрофилов CINC-1, -2αβ и -3. Изменения сохранялись вплоть до 6 месяцев после введения. Эта работа явилась, по-видимому, первым подтверждением того, что даже при однократном введении НЧ NiO вызывают стойкий воспалитель- ный ответ в легких. В аналогичной по дизайну работе повышение уровней CINC-2αβ и CINC-3 в БАЛ отмечалось через 3 дня, неделю, 3 и 6 месяцев после однократного интратрахеального введения крысам-самцам Wistar по 3,3 мг/кг наноструктурного агрегированного NiO с размером первичных НЧ 8,4 нм [12]. У крыс, однократно интратрахеально получавших НЧ NiO 26 нм в дозе 0,2 мг, в интервале времени 3 дня – 6 месяцев после введения наблюдали инфильтрацию альвеолярных макрофагов, длительное увеличение уровня MIP-1a и транзиторное – интерлейкинов (IL) – IL-1α, IL-1β и MCP-1 в лизатах легочной ткани и БАЛ [13]. Таким образом, хемокины играют важную роль в развитии легочного воспаления, вызванного Ni-содержащими НЧ.

Сферические и имеющие неправильную форму НЧ и нановолокна NiO, вводимые однократно интрат-рахеально самцам крыс F 344 в дозах 0,67–6,0 мг/кг массы тела, демонстрировали транслокацию в грудные лимфоузлы, где подвергались частичному растворению и биодеградации под воздействием окислителей, продуцируемых клетками иммунной системы. Скорость растворения, окисления и клиренса нановолокон Ni была значительно выше, чем для НЧ двух видов [14].

Связь между клиренсом из легких различных Ni-содержащих наноматериалов и их растворимостью была изучена также в работе [15]. Показано, что НЧ NiO обладали большей легочной токсичностью, чем микрочастицы (МЧ), поскольку они быстрее растворялись с высвобождением ионов Ni++, что было воспроизведено in vitro с использованием искусственной альвеолярной жидкости. Пиковый ответ маркеров воспаления в легких крыс отмечается in vivo в интервале от одной недели до одного месяца, и в гораздо меньшей степени в период – до 3 сут, что согласовалось с характерным временем растворения НЧ in vitro , которое составляет порядка одной недели. На роль растворимости Ni-содержащих наноматериалов и адсорбции на их поверхности компонентов сурфактанта в проявлениях ими легочной токсичности указывают и данные работы [16], в которой эффекты НЧ NiO у мышей при фарингеальной аспирации различались в зависимости от состава дисперсионной среды, включая фосфатно-солевой буфер, раствор альбумина, неионного детергента и фосфолипидов, имитирующих состав сурфактанта.

НЧ NiO в виде суспензии, вводимые однократно интратрахеально крысам, вызывали через 3–28 суток стойкое легочное воспаление с пролиферацией воспалительных клеток, альвеолярным протеинозом и продукцией цитокинов. Экспрессия Nlrp3 была повышена наряду с гиперэкспрессией каспазы 1 (p20) и IL-1 β , выделение которого подавлялось при действии ингибитора каспазы на макрофаги ex vivo . Предполагается, что НЧ NiO индуцируют активацию NLRP3-инфламмосомы, для чего требуется поглощение частиц клетками и выработка реакционноспособных форм кислорода (РСК) [17].

При однократном интратрахеальном введении крысам Sprague-Dawley в дозе 4–20 мг/кг НЧ Ni диаметром 41 нм и соответствующих МЧ (350 нм) через 14 сут воспроизведено воспалительное повреждение легких, печени и почек, гиперпластические изменения в легких и усиление в них экспрессии гемоксиге-назы-1 (НО-1) и Nrf2 без изменения экспрессии онкогена C-myc. Отмечались признаки более высокой цитотоксичности НЧ по сравнению с МЧ [18].

НЧ NiO вводили в эксперименте [19] однократно интратрахеально мышам и в интервале 1–28 сут исследовали воспалительные реакции в легких. Отмечено возрастание активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), общего белка, IL-6 и снижение IL-10 в БАЛ. В ткани легких возрастало содержание 8-оксо-2-дез-оксигуанозина (8-oxo-G) и каспазы-3 к 24-му часу опыта, отмечалось дозозависимое усиление воспаления нижних дыхательных путей. К 28-м суткам формировался фиброз легочной ткани. По данным проте-омного анализа через 24 ч в механизме воспаления преобладали нарушения в метаболических путях клеточной адгезии, тогда к 28-м суткам начинали доминировать процессы, связанные с истощением тканевого глутатиона.

Авторы исследования [20] вводили НЧ NiO крысам однократно интратрахеально в дозе 0,2 и 1 мг/кг или ингаляционным путем. Во всех тестах НЧ NiO дольше задерживались в легких, чем НЧ TiO2, причем биоперсистенция коррелировала с гистопатологическими изменениями и уровнями воспалительных биомаркеров в БАЛ.

При однократной интратрахеальной инстилляции НЧ Ni трех видов (c немодифицированной поверхностью, оксидно пассивированных и защищенных мономолекулярным слоем углерода) нормальным и нокаутным по гену микро-РНК (miR)-21 мышам показано, что только у мышей дикого типа под действием первых двух видов НЧ наблюдалось подавление экспрессии гена Reck (ингибитора метастазирования опухолей), являющегося непосредственной мишенью воздействия miR-21. Полученные данные указывают на важную роль miR-21 в индукции воспалительного ответа in vivo и возможной канцерогенности никелевых НЧ [21, 22]. В сравнительном исследовании на мышах, получавших путем однократной интратрахеальной инстилляции указанные три вида Ni-содержащих НЧ в дозе от 10 до 100 мкг, наблюдали дозозависимое развитие острого легочного воспаления с повышением в БАЛ количества нейтрофилов, CXCL1/KC, активности ЛДГ и общего белка. Временнáя динамика воспаления отличалась дебютом на первые сутки после введения, пиковым уровнем на 3-и сутки и снижением после 7-х сут, хотя и через 42 дня показатели воспаления были еще выше, чем в контроле. Оксидно пассивированные НЧ характеризовались практически такой же легочной токсичностью, как и НЧ чистого Ni, однако покрытие НЧ слоем углерода значительно снижало их токсичность [23].

Дегенерацию и некроз макрофагов, воспаление и пролиферацию пневмоцитов II типа отмечали в легких крыс Sprage-Dawley, которым выполняли однократную интратрахеальную инстилляцию НЧ NiO в дозах 0; 0,2; 0,67 и 2 мг/кг массы тела [24]. Межлабораторное исследование в пяти лабораториях подтвердило хорошую воспроизводимость разработанной методики.

Сравнение однократного или дробного (в два или четыре приема с суточными интервалами) интратрахе-ального введения НЧ NiO крысам в суммарной дозе 2 мг/кг массы тела показало, что последующее развитие легочного воспаления с такими проявлениями, как фагоцитоз НЧ альвеолярными макрофагами, их дегенерация и некроз, ответ воспалительных маркеров в БАЛ через 3 и 28 сут после последнего введения практически не различалось у животных, получавших дозу НЧ однократно или дробно [25].

Подострый экспериментальный сценарий экспозиции был реализован в работе [26], где НЧ или МЧ NiO вводили крысам-самцам линии Wistar ин-тратрахеально в дозах 0,015–0,25 мг/кг дважды в неделю в течение шести недель. В печени экспонированных животных повышалось количество клеток в апоптозе, экспрессия IRE-1α, X box белка-1S, панкреатической ER-киназы (PERK), эукариотического инициирующего фактора-2 альфа (eIF-2α), их фосфорилированных форм, каспаз-3, 9 и 12, регулируемого глюкозой белка 78 кД и CCAAT-энхансерсвязываю-щего белка, что указывает на развитие стресса эндоплазматического ретикулума.

В других работах той же группы авторов при введении НЧ NiO крысам в вышеуказанных дозах гистопатологическое исследование выявило фиброз легких, повышенное содержание в их ткани гидроксипролина, коллагена-1 и 3. Этому сопутствовало повышение экспрессии факторов фиброза TGF-1 β (TGF – трансформирующий фактор роста), Smad2, Smad4, металлопротеиназ матрикса (ММР) и их тканевого ингибитора (TIMP) [27]. При морфологическом исследовании отмечали дозозависимое расширение альвеолярных отростков, воспалительную инфильтрацию и отложение НЧ в легочной ткани. При наибольшей из доз присутствовали признаки нитративного стресса, включая повышение уровня NO и активности общей (tNOS) и индуцируемой NO-синтазы (iNOS); возрастало образование 8-oxo-G, повышались уровни IL-2, TGF- β и IFN- γ , начиная с дозы НЧ 0,06 мг/кг. Данные эффекты были достоверно более выражены при введении НЧ, чем эквивалентного по массе количества МЧ [28]. В развитии в легочной ткани иммунопатологической реакции в ответ на введение НЧ NiO центральную роль играла активация NF- κ B и повышение относительной доли Th2-лимфоцитов в сравнении с Th1 [29].

Согласно данным исследования S. Yu [30], подострое интратрахеальное введение НЧ NiO самцам крыс Wistar вызывало изменения в печени, включая возрастание массы органа, клеточный отек, закры- тие желчных протоков и многоядерные клетки. Активности синтаз NO и уровни NO в печени возрастали при дозе 0,25 мг/кг NiO. Помимо этого отмечено возрастание концентраций гидроксильного радикала, перекисей липидов, каталазы, глутатионпероксидазы и SOD. Таким образом, интратрахеальное введение НЧ NiO приводит к системным эффектам, включая повреждение печени.

Токсичность НЧ Ni для самцов и самок мышей была сопоставлена при двух режимах орофарингеальной инстилляции: в виде однократной дозы (в остром опыте) или растянуто в шесть приемов на протяжении трех недель. После острого введения у самцов повышалось содержание CXCL1 и IL-6 и количество нейтрофилов в БАЛ и усиливалось фосфорилирование STAT3 в легочной ткани. После подострого экспонирования НЧ Ni у самцов повышалось количество моноцитов в лаваже, отмечалась индукция CXCL1 и CCL2, а фосфорилирование STAT1 при этом режиме введения отмечалось только у самок. Для самцов была характерна бóльшая экспрессия в печени IL-6 при остром введении и CCL2 при подостром, чем у самок. Различия в реакции легких на введение НЧ Ni в большей степени определялось полом животных, чем режимом введения [31].

В работе Q. Zhang et al. [32] самцы крыс Wistar получали НЧ NiO в дозах от 0,015 до 0,25 мг/кг ин-тратрахеально два раза в неделю на протяжении девяти недель. В печени выявлено повышенное накопление коллагенов типа I и III, сопровождаемое повышенной экспрессией TGF- β 1, фосфорилированных Smad2, Smad3, α -актина, MMP9, TIMP1 и снижением E-кадгерина и Smad7, что указывает на развитие фиброза. Эти результаты были аналогичны полученным этими авторами в системе in vitro на культуре клеток печени, что указывает на возможность системной транслокации НЧ после их введения в дыхательные пути.

Ингаляционная экспозиция. Ингаляционное введение наноматериалов, осуществляемое путем помещения животного в аэрозольную камеру или с помощью специальных шлемов, надеваемых на голову, лучше воспроизводит ситуацию производственной экспозиции, чем непосредственное введение в дыхательные пути, и менее травматично. Вместе с тем оно сопряжено с рядом проблем, обусловленных необходимостью учета респирабельной (то есть действующей на нижние дыхательные пути) дозы, в отличие от ингалируемой дозы наноматериала, представленного в непосредственно вдыхаемом воздухе. Сопоставление эффектов двух способов экспозиции осуществлено в работе Y. Mizuguchi et al. [33], где самцы крыс Wistar получали НЧ NiO путем интратрахеальной инстилляции или подострой четырехнедельной ингаляции. Исследование проводили в широком интервале доз НЧ. Показано, что в обоих методах могут быть получены сопоставимые и воспроизводимые результаты по показателю полиморфноядерных лейкоцитов в БАЛ, если дозу наноматериала выражать через площадь поверхности, но не через массу или массовую концентрацию.

По данным исследования M. Horie et al. [34] ответ маркеров окислительного стресса в легких, включая НО-1, 8-изо-простагландин-F2α, тиоредоксин, миелопероксидазу и iNOS, на первой стадии воспалительного ответа развивается более интенсивно при интратрахеальном введении НЧ NiO по сравнению с ингаляцией, однако в дальнейшем различия между этими путями поступления нивелируются.

При сравнении воздействия на крыс при ингаляции в течение четырех недель НЧ NiO, многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) или фуллерена в дозах 0,13–0,37 мг/м³ NiO НЧ вызывали наиболее глубокие и грубые изменения в легких животных по содержанию фосфолипидов и SP-D (сурфактант-специфический белок D). Эффект МУНТ также присутствовал, хотя и был менее выражен, а признаков токсичности фуллерена выявлено не было [35]. При этом частицы NiO микронного размера и наночастицы TiO 2 продемонстрировали низкую легочную токсичность для крыс по данным экспрессии MMP-1, TIMP и коллагена типа 1. Эти данные показывают, что ингаляционная токсичность Ni-содержащих частиц, по-видимому, возрастает при их переходе в наноформу.

Наиболее продолжительное (10 месяцев) ингаляционное воздействие НЧ NiO на крыс осуществлено в работе М.П. Сутунковой и др. [36]. Концентрация наноматериала в аэрозоле составляла 0,23 ± 0,01 мг/м3. Исследование БАЛ показало изменение цитологических и ряда биохимических характеристик с парадоксально слабо выраженной гистопатологической картиной легочной ткани и сравнительно мало выраженным накоплением НЧ в легких. Вместе с тем наблюдали явления системной токсичности, включая повреждение печени и почек, аллергенное действие, транзиторную стимуляцию эритропоэза и проникновение НЧ NiO в головной мозг по ольфакторному пути. Геноксичность проявилась в фрагментации ДНК в ядерных клетках крови (RAPD-тест) с тенденцией к возрастанию по мере периода экспозиции. Установлена возможность ингибирования большого числа этих неблагоприятных эффектов путем перорального введения животным некоторых биопротекторов, включая витамины С и Е, рыбий жир, глицин, мононатрийглутамат и др. Вопросы использования пищевых веществ (антиоксидантов, ПНЖК, аминокислот) в качестве биопротекторов при действии токсичных наноматериалов, включая Ni-содержащие НЧ, рассматриваются в обзорных статьях [2, 37].

Особый интерес представляют факты наличия у Ni-содержащих НЧ кардиотоксичности и атерогенного действия при ингаляционном поступлении. Показано, в частности, что при ингаляции мышами C57BL/6 НЧ Ni(OH)2 диаметром до 40 нм в течение 5 ч в дозе 100–900 мкг/м3 в сонной артерии экспонированных животных снижалась вазоконстрикция под действием фенилэфрина и вазорелаксация в ответ на ацетилхолин. Тем самым даже относительно кратковременная ингаляционная экспозиция Ni-со-держащими НЧ вызывает изменения в эндотелии больших сосудов, удаленных от места внедрения наноматериала в организм [38]. В дальнейшем было показано, что при ингаляции в сходных условиях НЧ металлического Ni у мышей возрастало в костном мозге и в циркуляции количество стволовых эндотелиальных клеток (endothelial progenitor cells – EPCs), что указывает на повреждение эндотелия сосудов. Образование трубочек (tube formation) и хемотаксис ex vivo клеток EPCs от мышей, обработанных НЧ Ni, были существенно нарушены. Выявлено снижение числа отвечающих за мобилизацию и тканевую фиксацию рецепторов для мРНК на EPCs под действием НЧ [39]. В исследовании G.S. Kang et al. [40] отмечено, что ингаляция НЧ Ni(OH)2 в дозе 79 мкг Ni/м3 по пять дней в неделю в период от одной недели до пяти месяцев приводила к увеличению тяжести проявления атеросклероза сосудов у чувствительной линии мышей с нокаутом гена аполипопротеина Е (ApoE-/-).

Пероральное поступление. Исследования эффектов перорально вводимых никельсодержащих наноматериалов относительно немногочисленны, поскольку данный сценарий поступления не рассматривается в большинстве работ в качестве приоритетного. В исследовании N. Dumala et al. [41] острая пероральная токсичность НЧ NiO превышала 2000 мг/кг массы тела, что относило их к 5-му классу опасности в соответствии с Руководством 420 ОЭСР. По результатам 14-дневного наблюдения после острого перорального введения НЧ NiO размером около 16 нм самкам крыс Wistar в дозах от 5 до 2000 мг/кг массы тела смертность отсутствовала. У крыс, получивших НЧ NiO в дозе 2000 мг/кг, наблюдались заторможенность, раздражительность, незначительное снижение потребления корма, прироста массы тела и относительной массы органов. При наибольшей из доз, по данным комет-теста, наблюдали повреждения ДНК в печени и почках через 24 ч. Сходные результаты получены в микроядерном тесте. Изучение с использованием этой модели токсичности НЧ NiO показало достоверное снижение числа эритроцитов, ингибирование AchE в головном мозге крыс при высокой дозе НЧ. В печени и сыворотке повышалась, а в почках понижалась активность трансаминаз. При высокой дозе НЧ отмечалось нарушение баланса ферментов антиоксидантной защиты [42].

Подострая пероральная токсичность и биораспределение НЧ NiO размером 13 нм для крыс Wistar были изучены в 28-суточном эксперименте [43]. Отмечены гистопатологические изменения в ряде внутренних органов, рост активности трансаминаз в гомогенатах печени и почек, снижение активности SOD и возрастание активности каталазы. Отмечено истощение запасов восстановленного глутатиона и возрастание уровня малонового диальдегида, что указывало на развитие окислительного стресса. Основным местом накопления Ni была печень, далее – почки. Экскреция Ni происходила в основном с калом и в очень малой степени с мочой.

Исследование подострой пероральной токсичности НЧ Ni на самцах и самках крыс в дозах от 5 до 45 мг/кг массы тела в течение 10 недель (дизайн исследования соответствовал руководству Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) № 415) показало ультраструктурные изменения яичников и семенников, развитие окислительного стресса и экспрессию белков, связанных с апоптозом [44, 45]. В этих же работах было показано, что вводимая с пищей экзогенная аскорбиновая кислота защищает животных от поражения НЧ Ni.

Внутрижелудочное введение НЧ NiO размером около 50 нм самцам крыс Wistar в течение 7 или 14 сут в дозах от 1 до 4 мг/кг массы тела привело к значительному возрастанию числа хромосомных аберраций, микроядер, повреждению ДНК. Методом проточной цитометрии выявлено наличие апоптоза, генерация РСК и дисфункция митохондриального мембранного потенциала. В печени отмечался дисбаланс антиоксидантных ферментов и гистологические изменения. Методом иммуноблоттинга показано взаимодействие p53 и MAPK-сигнального пути (MAPK – активируемая митогенами протеинкиназа) с активацией MAPAPK-2 (субстрата фосфорилирования для p38 MAP-киназы), каспаз 3, 8, выходом из митохондрий цитохрома С, экспрессией Bax (Bcl-ассоциированный Х-белок) и подавлением внутриклеточного регулятора апоптоза (Bcl-2) [46].

Антагонизм токсического действия по ряду интегральных и биохимических параметров выявлен после однократного перорального совместного введения крысам 0,5 или 1 г НЧ NiO и НЧ Co3O4. Каждый из наноматериалов был более токсичным для крыс по отдельности, чем в сочетании [47].

Отдаленные эффекты токсического действия Ni-содержащих наноматериалов.

Канцерогенность Ni-содержащих НЧ in vivo. Механизмы индуцированного металлами канцерогенеза до конца не изучены. Как следует из представленных выше данных, для действия НЧ Ni и его соединений характерно усиление окислительного стресса, воспалительная реакция и ингибирование факторов апоптоза, то есть те негенетические патологические факторы, которые могут предрасполагать к канцерогенности. Помимо этого, в модельных системах in vitro у НЧ Ni и NiO была выявлена высокая генотоксичность и мутагенность, а также возможность индукции злокачественной трансформации определенных клеточных линий. Ввиду этого представляется актуальным изучение канцерогенности различных Ni-содер-жащих наноматериалов in vivo. Такие работы, однако, в доступной литературе почти отсутствуют. В единственном исследовании (T. Hansen et al. [48]) наблюдали развитие рабдомиосарком у крыс, которым вводили в позвоночник импланты, содержащие НЧ Ni. В меха- низме канцерогенеза, возможно вызываемого соединениями Ni, значительную роль могут играть эпигенетические механизмы [3, 49]. Предполагают, что поглощение НЧ Ni клетками является критически важной стадией, определяющей их канцерогенность [50]. При этом известно, что на поглощение сильно влияет поверхностный заряд частицы, что необходимо учитывать при планировании экспериментов in vivo.

Таким образом, установление канцерогенности НЧ Ni и других Ni-содержащих наноматериалов при естественных путях их поступления в организм требует дополнительных исследований.

Иммунотоксичность и аллергенность. Аллергенные свойства НЧ Ni в значительной степени определяются наличием у них иммунотоксичности и могут проявляться как при контактном действии (при нанесении на кожу) [51], так и при поступлении через органы дыхания и желудочно-кишечный тракт [4].

У самок крыс Wistar однократное интратрахе-альное введение НЧ NiO в дозах от 50 до 200 см2 в расчете на площадь поверхности частиц привело к повышению уровней маркеров воспаления в гуморальной и клеточной фракциях БАЛ. При этом количество эозинофилов не коррелировало с уровнем общего IgE и анафилотоксинов, а степень лизиса альвеолярных макрофагов и активность внеклеточной ЛДГ положительно коррелировали с высвобождением eotaxin. Был сделан вывод, что накопление НЧ в фаголизосомах клеток иммунной системы провоцирует их лизис, сопровождающийся продукцией eotaxin и эозинофилией. Аллергенные свойства НЧ NiO, таким образом, сопоставимы с таковыми у соли Ni, а также овальбумина [52].

По данным исследования E.E. Glista-Baker et al. [53], транскрипционный фактор Tbx21 (T-bet) играет роль в предотвращении переключения иммунного ответа на антиген с Th1- на Th2-тип и, следовательно, необходим для предотвращения развития аллергических реакций, таких как бронхиальная астма. В исследовании использовали мышей с нокаутом гена Tbx21, имеющих генотип T-bet-/-, в сравнении с животными дикого типа. При гистопатологическом исследовании животных, обработанных наноматериалами путем орофарингеальной аспирации, показано, что у T-bet-/- мышей на 21-е сут после ингаляционного введения НЧ Ni была достоверно повышена метаплазия клеток в слизистой оболочке альвеол в сравнении с контролем. Аналогичный эффект в случае МУНТ был менее выраженным. У мышей T-bet-/- на 21-е сут развивался хронический альвеолит под действием НЧ Ni, но не МУНТ. В опытной группе наблюдался более высокий уровень экспрессии MUC5AC и MUC5B под действием НЧ Ni, чем в контроле. Уже через сутки у T-bet-/-мышей, получавших НЧ Ni, повышался уровень IL-13, CCL2 и количество эозинофилов в БАЛ (бронхоальвеолярном лаваже). Обработка мышей T-bet-/- моноклональными антителами к CCL2 повышала у них метаплазию в слизистой оболочке и экспрессию MUC5AC. Полученные данные подтверждают роль T-bet в защите от аллергенного действия НЧ Ni.

В исследовании K.A. Roach et al. [54] сказано, что мыши получали двукратно фарингеальные аспирации НЧ (диаметром 42 нм) или МЧ (181 нм) NiO на первые и 19-е сут опыта в дозе 3–40 мкг и параллельно были парентерально сенсибилизированы овальбумином. Экспозиция к NiO в сопоставимых по площади поверхности дозах приводила к изменениям в уровнях общего IgE, уровнях цитокинов в крови и в легких. При низкой вводимой площади поверхности иммунный ответ развивался преимущественно по Th2-пути, а при высокой площади поверхности происходило переключение в направлении Th1-типа. В случае высоких доз НЧ наблюдалось возрастание легочной эозинофилии.

На возможность переключения иммунного ответа в направлении Th2-типа, способствующего развитию аллергической реакции, указывают данные работы [29], в которой интратрахеальное введение НЧ NiO крысам-самцам Wistar приводило к усилению экспрессии GATA-3 и T-bet на фоне повышения уровней цитокинов TNF- α , IL-2, IL-10 и нейтрофильных хемоаттрактантов CINC-1, CINC-2 αβ и CINC-3.

Для НЧ Ni была показана возможность усиления аллергической сенсибилизации мышей в сочетании с липополисахаридом при подкожном введении [55]. Подобным же действием обладали НЧ серебра, но не ионы Ag+, НЧ золота и аморфного SiO2.

Репродуктивная токсичность. При введении НЧ Ni диаметром 90 нм самкам крыс внутрижелу-дочно через зонд в дозе 3–45 мг/кг ежедневно в течение 14 сут в ткани яичников отмечено набухание митохондрий, исчезновение в них крист, а также увеличение размеров эндоплазматического ретикулума. Достоверно снижалась активность SOD, каталазы, повышалось содержание РСК, малонового диальдегида и NO. Достоверно увеличивалась экспрессия мРНК каспаз-3,8 и 9, Fas, цитохрома С, Bax и Bid. Одновременно снижалась экспрессия Bcl-2. Действие МЧ Ni по ряду показателей было слабее, чем у НЧ [44]. В последующем исследовании эти авторы перорально экспонировали самцов крыс НЧ Ni диаметром 90 нм в дозах 15–45 мг/кг массы тела ежедневно в течение 10 недель перед спариванием и оценивали количество оплодотворенных самок. В семенниках экспонированных самцов отмечено снижение активности SOD, каталазы и уровня гонадостимулирующего гормона GSH. Наряду с этим повышалось содержание NO, малонового диальдегида и РСК. Повышалась экспрессия каспаз 3,8 и 9, снижалась – Bcl-2-aссоциированного X белка (Bax) и апоптозин-дуцируемого фактора (AIF). Указанные эффекты могли быть частично ингибированы введением животным высоких доз аскорбиновой кислоты, что указывает на их прооксидантную природу [45].

После введения самцам мышей ICR однократно внутрижелудочно через зонд НЧ Ni 90 нм в дозах от

5 до 45 мг/кг массы тела через 30 сут выявлен апоптоз клеток сперматофорных трубочек, снижение индекса массы семенников, активности в них маркерных тканевых ферментов, подвижности сперматозоидов [56].

При подостром интратрахеальном введении самцам крыс Sprage-Dawley НЧ NiO в дозе порядка 1 мг один раз в три дня на протяжении трех месяцев отмечалось снижение общего числа сперматозоидов, числа живых клеток, возрастание количества морфологически аномальных сперматозоидов. У самок, спаривавшихся с этими самцами, повышалось количество мертвых плодов. В сперме и плазме крови самцов возрастала концентрация Ni, которая коррелировала со снижением показателей сперматогенеза [57].

Список наиболее значимых генетических и молекулярных маркеров токсичности Ni-содержа-щих НЧ, по данным исследований in vivo, представлен в табл. 1.

Экспериментальные оценки для величины максимальной недействующей дозы (NOAEL) для Ni-содержащих НЧ, по данным ряда источников, представлены в табл. 2. В большинстве случаев авторам работ не удалось установить уровень NOAEL, ввиду чего дается ее оценка «сверху» согласно выявленным токсическим эффектам.

Токсичность в клинических наблюдениях. Несмотря на предположительно высокую вероятность экспозиции к НЧ, содержащим Ni и его соединения, на производстве [2], клинические и эпидемиологические наблюдения вредного действия этих наноматериалов на организм человека немногочисленны. Путем ретроспективного анализа случаев в организме больных, умерших от лимфомы Ходжкина, были обнаружены НЧ тяжелых металлов, включая Ni, которые рассматриваются в связи с этим как фактор, возможно, провоцирующий это новообразование [58]. В другом исследовании было показано, что рабочие, контактировавшие на производстве с нанопорошком Ni, испытывали раздражение горла, заложенность носа, покраснение лица и кожные реакции в отсутствие профилактических мер [59]. Описан клинический случай, в котором мужчина, занимавшийся дуговой обработкой металла, в ходе чего происходила ингаляционная экспозиция НЧ Ni, умер из-за респираторного дистресс-синдрома. На аутопсии выявлено присутствие НЧ Ni диаметром 25 нм в легочных макрофагах, повышенные уровни Ni в биологических жидкостях и тубулярный некроз почек [60].

Выводы. Таким образом, анализ литературы показывает, что НЧ металлического Ni, его соединений (NiO, Ni(OH) 2 ), а также никелевые нановолокна и наностержни при поступлении в организм как вследствие парентерального введения, так и естественными путями, через органы дыхания и желудочно-кишечный тракт характеризуются местным и системным токсическим действием; последнее связано со способностью этих НЧ к транслокации в органы, удаленные от места первичного введения, с током крови или лимфы.

Таблица 1

Наиболее значимые биомаркеры токсического действия Ni-содержащих наноматериалов in vivo

№ п/п	Наименование	Сокращенное обозначение	В чем определяли	Источник
1	Интерлейкины	IL-1 α , IL-1 β , IL-2, IL-6, IL-8, INF- γ , TNF- α	Легкие, БАЛ	[17, 28, 31] [13]
2	Металлопротеазы матрикса	MMP 2, 9	Легкие, печень	[27] [32]
3	Ингибиторы металлопротеаз матрикса	TIMP 1,3	То же	[32]
4	Микро-РНК 210	miR210	Легкие	[21, 22]
5	8-оксо-2-дезоксигуанозин	8-oxo-G	То же	[19]
6	Глутатион	GSH	Печень	[7]
7	Супероксиддисмутаза	SOD	Плазма крови, головной мозг	[9]
8	Каталаза	Cat	То же	[9]
9	Малоновый диальдегид	MDA	То же	[9]
10	Хемокины	MIP-1a, MCP-1, CINC-1, CINC-2 αβ , CINC-3	Легкие, БАЛ	[11, 13]
11	Каспазы 1,3,8,9,12	–	Легкие, печень, яичники	[19, 26, 44, 46]
12	Гемоксигеназа-1	HO-1	Легкие	[18]
13	Лактатдегидрогеназа	ЛДГ	Легкие	[19]
14	Ядерный транскрипционный фактор эритроид-2	NRF-2	Легкие	[18]
15	Ядерный транскрипционный фактор T-bet	Tbx21	Легкие	[29]

Таблица 2

Оценка максимальных недействующих доз (NOAEL) для НЧ Ni и его соединений по данным литературы

Наноматериал (состав, размер частиц)	Экспериментальная модель	Исследуемые показатели*	Оценка для NOAEL, ед. изм.	Источник
Интратрахеальное и ингаляционное введение
NiO 8–26 нм	Крысы Wistar	CINC-1, CINC-2 αβ , CINC-3 в БАЛ	< 0,33 мг/кг	[11]
NiO 8.4 нм	Крысы Wistar	CINC-1, CINC-2 αβ , CINC-3 в БАЛ	< 3,3 мг/кг	[12]
NiO 26 нм	Крысы	Цитокины в БАЛ	< 0,2 мг/кг	[14]
Ni 41 нм	Крысы Sprage-Dawley	Гистопатология, ГО-1, NRF-2 (легкие)	< 4 мг/кг	[18]
NiO	Крысы	Гистопатология внутренних органов	< 0,2 мг/кг	[20]
Ni	Мыши	Нейтрофилы, ЛДГ, CXCL1/KC в БАЛ	< 0,4 мг/кг	[23]
NiO	Крысы Sprage-Dawley	Гистопатология, (легкие)	< 2 мг/кг	[24]
NiO	Крысы	Гистопатология, (легкие)	< 2 мг/кг	[25]
NiO	Крысы	Индекс апоптоза (печень)	0,015 мг/кг	[26]
NiO	Крысы Wistar, самцы	Гистопатология, (печень)	< 0,25 мг/кг	[30]
Ni 20 нм	Мыши, самцы и самки	Макрофаги, ЛДГ в БАЛ	4 мг/кг (самки)	[31]
NiO 10–20 нм	Крысы Wistar, самцы	Полиморфноядерные лейкоциты в БАЛ	200 см2 на крысу	[33]
NiO 15–35 нм	Крысы Fischer 344, самцы	ГО-1 (легкие)	< 0,2 мг/кг	[34]
NiO 23 нм	Крысы самки **	Нейтрофилы и макрофаги в БАЛ, гистопатология печени, почек, селезенки	< 1 мг/м3	[36]
NiO 54 нм	Крысы Wistar, самцы	Компоненты сурфактанта в БАЛ	< 0,2 мг/м3	[35]
Ni (OH) 2	Мыши C57Bl/6J, самцы	Фармакологически стимулированная вазоконстрикция, вазорелаксация	< 0,15 мг/м3	[38]
Ni	Мыши ApoE (–/–)	Атеросклероз сосудов	< 0,08 мг/м3	[40]
Пероральное введение
NiO 20 нм	Крысы Wistar, самки***	Генотоксичность (костный мозг), активность ферментов (сыворотка крови, печень, почки)	125 мг/кг	[41, 42]
NiO 13 нм	Крысы Wistar, самцы и самки	Гематологические показатели, гистопатология (печень)	< 50 мг/кг	[43]
Ni 90 нм	Крысы Sprage-Dawley, самцы	Глутатион (гонады)	< 5 мг/кг	[45]
NiO 50 нм	Крысы Wistar, самцы	Апоптоз (костный мозг)	< 1 мг/кг	[46]
NiO 50 нм	Крысы Wistar, самцы ***	Интегральные, биохимические и гематологические показатели	< 1 г/кг	[47]

П р и м е ч а н и е : * – сокращения – см. табл. 1; ** – субхронический опыт (10 мес.); *** – острый опыт (однократное введение).

Токсичность как НЧ, так и соединений Ni традиционной степени дисперсности в определенной степени связана с их способностью к переносу через мембраны и биологические барьеры, растворению и биодеградации в организме. При прочих равных условиях более растворимые НЧ (NiO) оказываются более токсичными, чем менее растворимые НЧ металлического Ni, а также МЧ. С другой стороны, Ni-содержащие НЧ в ряде случаев оказываются даже более токсичными, чем растворимые соли никеля, из-за большей способности у первых к проникновению через мембраны в клетки. Это является еще одним подтверждением положения о том, что по своему действию на биологические системы вещества в наноформе могут существенно отличаться от их аналогов обычной степени дисперсности, и характеристика опасности наноматериалов необходима в каждом отдельном случае [61].

Для Ni-содержащих наноматериалов отмечено общетоксическое, органотоксическое (включая гепа-тотоксическое и кардиотоксическое), атерогенное, фиброгенное, аллергенное, иммунотоксическое действие, репродуктивная токсичность. Вместе с тем данные экспериментов in vitro , свидетельствующие о наличии у Ni-cодержащих наноматериалов генотоксичности, мутагенности, трансформирующей активности, практически совершенно не подтверждены в хронических экспериментах in vivo по установлению у этих наноматериалов канцерогенных свойств. Ввиду этого канцерогенность Ni и его соединений в наноформе остается дискутабельной.

Экспериментальные оценки максимальных недействующих доз и концентраций Ni-содержащих наноматериалов показывают, что, независимо от размера частиц и состава наноматериала, они находятся при введении в дыхательные пути в диапазоне менее 0,2 мг/кг массы тела или 1 мг/м3. Достаточно надежных оценок максимальных недействующих и токсических доз при многократном (подостром и хроническом) пероральном поступлении данной группы наноматериалов в настоящее время не получено.

Необходимым звеном в методике оценки риска является определение экспозиции человека изучаемыми вредными факторами на производстве, через объекты окружающей среды и потребительскую продукцию. К сожалению, в настоящее время применительно к НЧ Ni и его соединений такая информация практически отсутствует. Исключение составляют единичные сообщения о выявлении Ni-содержащих НЧ в воздухе рабочей зоны металлургических предприятий. Это не позволяет завершить оценку риска НЧ Ni, в том числе присутствующих в пищевой продукции и в воде в качестве остаточных количеств никелевых катализаторов или вследствие загрязнения этими наноматериалами окружающей среды.

Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема Минобрнауки России № 0529-2019-0057 «Разработка системы качества и безопасности пищевой продукции, в том числе пищевых добавок и спиртсодержащих напитков, полученных биотехнологическими методами»).