Оценка токсического действия аминогликозидных антибиотиков на образовательную ткань корней лука

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 577.181.5:581.432:635.25/26                     

Аминогликозиды относятся к группе антибиотиков, ингибирующих белковый синтез у бактерий [1–2]. Эти антибиотики проникают внутрь клеток бактерий и связываются с рибосомами, синтезирующими бактериальные белки, тем самым блокируя биохимические процессы, происходящие в клетках. Парализованная бактерия теряет возможность размножаться и расти, чего бывает достаточно, чтобы избавиться от некоторых инфекций. Нарушение синтеза белка происходит на стадии взаимодействия с рибосомами путем блокирования связывания транспортной т-РНК с 30S-субъединицами рибосом [2–3]. Избирательность действия аминогликозидов на бактериальную клетку обеспечивается существенным различием рибосом у бактерий и эукариот. Частицы бактериальных рибосом, обозначаемые по коэффициенту седиментации как 50S- и 30S-частицы, отличаются по способности связываться с антибиотиками от частиц рибосом эукариотов, соответственно, 60S- и 40S-частиц. По этой причине цитоплазматические рибосомы животной клетки реагируют с ними гораздо слабее или вообще не связывают указанные антибиотики. Однако в группе аминогликозидов существуют антибиотики, блокирующие синтез белка, реагирующие с рибосомами и микроорганизмов, и животной клетки. В медицинской практике они не используются, но производятся как реагенты для биохимических и молекулярно-биологических исследований (например, антибиотик циклогексимид) [4].

Цель работы: изучить влияние аминогликозидных антибиотиков (амикацина, гентамицина, канамицина, стрептомицина) и цитокинина 6-БАП на митотическую активность клеток образовательной ткани корней лука обыкновенного.

Методика исследований

Исследование ответных реакций растений лука обыкновенного в условиях действия водных растворов антибиотиков выполняли с помощью Allium-теста [5] на сорте «Стурон». В качестве контроля использовали очищенную водопроводную воду.

Тестировали следующие антибиотики: амикацин (Синтез АКОМП, Россия) в концентрации 500,0 мг/л, гентамицин (гентамицина сульфат, РУП «Белмедпрепараты», Беларусь) — 50,0 и 100,0 мг/л; стрептомицин (стрептомицина сульфат; ЗАО «Брынцалов-А», Россия) — 150,0 и 1000,0 мг/л; канамицин (ЗАО «Брынцалов-А», Россия) — 100,0 и 1000,0 мг/л; и цитокинин 6-бензиламинопурин (6-БАП) (Sigma-Aldrich, USA) — 5,0 мг/л.

Давленые    препараты    для    цитогенетического    анализа,    окрашенные ацетогематоксилином, изготавливали по общепринятой методике [6].

Просмотр препаратов осуществляли на компьютеризированной кариологической станции, оснащенной микроскопом Leica DMR при увеличении 40×10×1,5.

Цитогенетический анализ выполняли по общепринятой методике [6].

По каждому варианту опыта определяли:

• 1)    митотический индекс (МИ) по совокупности корней с митозом;

• 2)    МИ* для всех просмотренных корней.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета прикладного программного обеспечения Microsoft Excel и «Statsoft (USA) Statistica v.7.0. Для данных, подчиняющихся нормальному закону распределения, использовали t-критерий Стьюдента [7].

Результаты исследований

При микроскопировании препаратов в вариантах опыта наблюдали в апикальной меристеме некоторых придаточных корней лука отсутствие деления (Таблица). Митотический индекс был близок к 0 и большинство клеток находились в профатическом состоянии. Применение гентамицина и стрептомицина во всех вариантах опыта подавляла митотическую активность у 70,0–88,9% корешков на момент фиксации материала. Полагаем, что это своеобразный адаптационный механизм на клеточном уровне при действии стрессовых факторов.

Таблица.

ВЛИЯНИЕ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ И 6-БАП

НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ МЕРИСТЕМНЫХ КЛЕТОК КОРЕШКОВ ЛУКА ОБЫКНОВЕННОГО

№ варианта опыта	Тестируемые вещества, концентрация в мг/л	Число корешков с митозом, %
1	вода водопроводная	100,0
2	6-БАП, 5,0	68,8
3	гентамицин, 50,0	86,4
4	гентамицин, 100,0	70,0
5	гентамицин, 100,0 + 6-БАП, 5,0	84,4
6	стрептомицин, 150,0	81,0
7	стрептомицин, 1000,0	82,4
8	стрептомицин, 1000,0 + 6-БАП, 5,0	88,9
9	амикацин, 500,0	100,0
10	канамицин, 100,0	100,0
11	канамицин, 1000,0	100,0

Амикацин и канамицин не влияли на митотическую активность в меристематических клетках корешков лука. Следует отметить, что 6-БАП в комбинации с гентамицином и стрептомицином приводит к тенденции увеличения доли корней с митозом.

Результаты других исследований также свидетельствуют о подавлении корнеобразования у семян кукурузы [8] и однопочечных сегментов побегов в культуре тканей разных видов березы [9] при проращивании в растворах либо средах с добавлением гентамицина, соответственно, в концентрации 20–40 мг/л и 50–300 мг/л.

Установлено, что тестируемые концентрации аминогликозидных антибиотиков подавляют митотическую активность в образовательной ткани придаточных корней лука. Существенно, в 1,6–2,5 раза, снижается МИ в вариантах применения 6-БАП, гентамицина, стрептомицина в концентрации 1000,0 мг/л, амикацина и канамицина (Рисунок).

Повышение концентрации гентамицина с 50 мг/л до 100,0 мг/л, стрептомицина со 150,0 мг/л до 1000,0 мг/л, канамицина со 100,0 мг/л до 1000 мг/л не оказывает существенного негативного влияния на митотическую активность клеток меристем (Рисунок).

Если анализировать совместное действие 6-БАП и гентамицина, то следует отметить, что данная комбинация повлияла на увеличение МИ. В то время как при совместном применении 6-БАП и стрептомицина установлено снижение митотической активности клеток.

к 10

10,2

10,2

и МИ

и МИ*

7,20                      7,2

7,2  7,2

6,26,2 6,10

5,35,155,00416,1         6,35,10   6,26,26,106,15,35,3

2       3       4       5       6       7       8       9      10      11

варианты опыта

Рисунок. Влияние тестируемых веществ на митотический индекс. Варианты опыта: 1 — контроль; 2 — 6-БАП, 5,0 мг/л; 3 — гентамицин, 50,0 мг/л; 4 — гентамицин, 100,0 мг/л; 5 — гентамицин, 100,0 мг/л + 6-БАП, 5,0 мг/л; 6 — стрептомицин, 150,0 мг/л; 7 — стрептомицин, 1000,0 мг/л; 8 — стрептомицин, 1000,0 мг/л + 6-БАП, 5,0 мг/л; 9 — амикацин, 500,0 мг/л; 10 — канамицин, 100,0 мг/л; 11 — канамицин, 1000,0 мг/л; МИ — учитывали корешки с митозом; МИ* — учитывали все просмотренные корешки.

В обоих вариантах совместного применения цитокинина и тестируемых аминогликозидных антибиотиков отмечено влияние 6-БАП на прохождение митоза. Необходимо напомнить, что цитокинины стимулируют экспрессию специфического циклина и ускоряют переход от фазы G2 к митозу [10].

Однако на разных стадиях клеточного цикла синтезируются разные циклины, которые к окончанию митоза быстро разрушаются протеиназами [6, 11–12]. Вышесказанное частично объясняет полученные значения МИ при использовании 6-БАП (Рисунок).

Заключение

Таким образом, в вариантах опыта с 6-БАП, тестируемыми аминогликозидными антибиотиками (кроме амикацина и канамицина) при микроскопировании препаратов в апикальной меристеме у 68,8–88,0% придаточных корней лука наблюдали отсутствие деления. Митотический индекс был близок к нулю и большинство клеток находились в профатическом состоянии.

Установлено, что тестируемые концентрации аминогликозидных антибиотиков подавляли митотическую активность в образовательной ткани придаточных корней лука. Существенно, в 1,6–2,5 раза, снижается МИ в вариантах применения 6-БАП, гентамицина, стрептомицина в концентрации 1000,0 мг/л, амикацина и канамицина.