Оценка токсичности почвы, загрязненной бенз[a]пиреном

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) относятся к высоко опасным для человека поллютантам (Ifegwu, Anyakora, 2015). Они образуются при сжигании и переработке нефтепродуктов, угля, древесины, бытовых отходов и др. Чаще всего показателем присутствия ПАУ в окружающей среде служит бенз[a]пирен (БП). Он является канцерогеном, мутагеном, токсикантом 1-го класса опасности. Предельно допустимая концентрация (ПДК) БП в почве составляет 20 нг/г (СанПин 1.2.3685-21), для растений

ПДК БП и других ПАУ не установлены.

Растения способны поглощать, аккумулировать, синтезировать и участвовать в деградации ПАУ (Яковлева, Габов, 2019). При действии поллютантов у растений возникает неспецифическая ответная реакция - окислительный стресс. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - цепной процесс свободнорадикального окисления, в ходе которого изменяется структура биомолекул, происходит инактивация ферментов, образуются дефекты в липидном слое мембран. В результате ПОЛ образуется малоновый диальдегид (МДА).

Ранее (Абдухалилов, Скугорева, 2019) нами было показано, что БП в дозе 10 ПДК приводил к усилению процессов ПОЛ и снижению накопления фотосинтетических пигментов у 15-суточных растений ячменя при выращивании на гидропонике. В работе (Яковлева и др., 2015) выявлено, что загрязнение песчаного субстрата 0.5–2 ПДК БП приводило к уменьшению всхожести семян до 80 %, снижению высоты и биомассы 30-суточных растений ячменя до 3.6 раза. При внесении в почву 2 ПДК БП наблюдали ростстимулирующий эффект: усиление накопления биомассы проростками, увеличение длины корня, снижение интенсивности ПОЛ в побегах проростков полевого гороха (Скугорева и др., 2021а). В ризосфере растений отмечается высокая активность микроорганизмов, способных использовать ПАУ в качестве единственного источника углерода и энергии (Gatqzka, Grzqdziel, 2016). Известно, что в результате загрязнения ПАУ значительно изменяется структура почвенных бактериальных сообществ (Ажогина и др., 2020). Повышенное содержание ПАУ в городских почвах, особенно вблизи автодорог, может приводить к изменению в структуре микробных комплексов (Скугорева и др., 2021б). В модельном опыте внесение 1 и 2 ПДК БП приводило к снижению численности почвенных микроорганизмов (Скугорева и др., 2021а).

Целью работы было оценить токсичность почвы, загрязненной бенз[a]пиреном, по влиянию на проростки кресс-салата, почвенную микробиоту, простейших Paramecium caudatum и бактериальную тест-систему «Эколюм».

Материалы

Модельный эксперимент выполняли с использованием почвы, отобранной с агроучастка на территории Кирово-Чепецкого района Кировской области, на которой преобладают дерново-подзолистые почвы. Отбор почвы проводили из верхнего слоя (0– 15 см). Почва имела нейтральную (рНН2О 6.5 ± 0.1) или близкую к нейтральной реакцию (рНKCl 5.6 ± 0.1). Содержание органического вещества составило 1.20 ± 0.20 %, что характеризует почву как малогумусную. Обеспеченность почвы нитратным азотом для растений низкая (2.60 ± 0.30 мг NO3-/кг); фосфором (72.6 ± 3.5 мг Р205/кг) и калием (81 ± 12 мг К2О/кг) – средняя. Концентрация БП в почве была ниже предела обнаружения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4.1.1274-03..., 2003).

Методы

Предварительно почву подсушивали до воздушно-сухого состояния, измельчали и просеивали через сито с размером ячейки 1 мм. В чашки Петри насыпали почву массой 40.0 г. Бенз[a]пирен вносили в дозах 0.2 и 0.4 мкг/г почвы, что соответствовало 10 и 20 ПДК БП, в виде водного раствора, приготовленного из ГСО БП (7515-98 МСО 0184:2000). Контрольный вариант – без внесения БП. Повторность в опыте трехкратная. После внесения в почву БП проводили посев семян кресс-салата по 30 шт. на чашку Петри. Затем чашки помещали в климатическую камеру, где осуществляли контроль фотопериода: день (12 ч) / ночь (12 ч). Температура на протяжении всего опыта составляла 20 ± 2 °С. Полив растений осуществляли регулярно дистиллированной водой из расчета 60 % от полной влагоемкости почвы. Эксперимент длился 10 суток.

На 8-е сутки от момента посадки определяли всхожесть семян (ГОСТ 12038-84). После окончания опыта (на 11-е сутки) растения извлекали из почвы, измеряли высоту побега и длину корня, а также их сырую биомассу. Содержание МДА определяли в побегах проростков в трехкратной повторности. Накопление МДА - спектрофотометрическим методом ( λ = 532 нм) по окраске вытяжки из свежих растительных тканей после 30 мин кипячения на водяной бане с 0.5 % раствором тиобарбитуровой кислоты в 20 % трихлоруксусной кислоте (Лукаткин, Голованова, 1988).

Численность микроорганизмов в почве высчитывали методом предельных разведений на селективных питательных средах в трехкратной повторности: аммонификаторы (ГРМ-агар), азотфиксаторы (среда Эшби) и грибы (среда Чапека).

Острую токсичность проб почв определяли с использованием бактериальной тест-системы «Эколюм» и простейших Paramecium caudatum. Первый метод основан на измерении интенсивности биолюминесценции препарата лиофилизированных бактерий Escherichia coli. Подготовку и тестирование проб почвы проводили в соответствии с методикой ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.1104, Т 16.1:2.3:3.8-04. Методика предполагает три пороговых уровня индекса токсичности (Т): 1) допустимая степень токсичности образца при Т < 20; 2) образец токсичен при 20 ≤ Т < 50; 3) образец сильно токсичен при Т ≥ 50. Второй метод основан на хемотаксической реакции инфузорий P. caudatum. Согласно ФР.1.39.2015.19243, количественная оценка токсичности выражается в виде индекса токсичности (Т), по величине которого анализируемые пробы делятся на три группы: I) допустимая степень токсичности (0.00 < Т ≤ 0.40); II) умеренная степень токсичности (0.41 < Т ≤ 0.70); III) высокая степень токсичности (Т > 0.71).

В таблицах приведены средние арифметические значения и ошибки средних. Достоверность расхождений средних арифметических значений с контролем устанавливали при помощи t -критерия Стьюдента.

Результаты

В ходе исследования установлено, что в присутствии БП в почве в дозах 10 и 20 ПДК всхожесть семян кресс-салата составила 94.4 и 93.3 %, что практически не отличалось от значения в контроле (94.4 %). Внесение БП в почву не оказывало влияния на ростовые параметры проростков кресс-салата: длину корня и высоту побега (рис. 1).

Варианты опыта

Рис. 1. Ростовые параметры проростков кресс-салата при внесении в почву различных доз бенз[a]пире-на

Fig. 1. Growth parameters of garden cress seedlings when various doses of benz[a]pyrene are introduced into the soil

Кроме линейных параметров, у растений измеряли биомассу (рис. 2). Выявлено, что в варианте опыта с дозой 20 ПДК БП происходило достоверное снижение накопления сырой биомассы корнями. Значение сырой биомассы корней в данном варианте составило 10.0 ± 0.8 мг на одно растение, что в 1.47 раза ниже значения для растений в контроле (14.7 ± 0.7 мг / растение).

Наиболее чувствительным параметром к действию БП оказалось накопление МДА растениями кресс-салата. Внесение в почву данного ПАУ в дозах 10 и 20 ПДК приводило к увеличению содержания МДА в побегах растений в 1.69 и 1.60 раза по сравнению с контролем соответственно (рис. 3).

Результаты количественного учета микроорганизмов в почве приведены в табл. 1. Вы- явлено угнетающее действие БП на численность гнилостных бактерий (аммонификаторов): в 1.92 раза по сравнению с контролем при 10 ПДК и в 5.33 раза при 20 ПДК.

Для группы азотфиксаторов концентрация БП 10 ПДК оказала стимулирующее действие в 2.95 раза и угнетающее действие в 2.23 раза при концентрации 20 ПДК. Бенз[а] пирен в дозе 10 ПДК неожиданно приводил к активизации размножения микромицетов в 4.54 раза по сравнению с контролем, а при 20 ПДК угнетающее действие не проявилось.

Изучение структуры популяции (табл. 2) выявило доминирование аммонификаторов в контроле и азотфиксаторов – в вариантах с БП. Во всех вариантах минорным компонентом микробиоты являются грибы, чья доля в структуре популяции тем не менее

Варианты опыта

Рис. 2. Биомасса проростков кресс-салата при внесении в почву различных доз бенз[a]пирена. * – различия с контролем достоверны при р < 0.05

Fig. 2. Biomass of garden cress seedlings after application of various doses of benz[a]pyrene to the soil. * – differences with the controls are significant at p < 0.05

Рис. 3. Накопление МДА в побегах растений кресс-салата при внесении в почву различных доз бенз[a] пирена. * – различия с контролем достоверны при р < 0.01

Fig. 3. Accumulation of MDA in shoots of garden cress plants when various doses of benz[a]pyrene are introduced into the soil. * – differences with the controls are significant at p < 0.01

Таблица 1. Влияние бенз[а]пирена на численность почвенной микробиоты (·103 КОЕ / г сухой почвы)

Вариант	Аммонификаторы	Азотфиксаторы	Грибы	Всего
Контроль	160 ± 35	120 ± 13	4.3 ± 0.5	284 ± 48
10 ПДК БП	83 ± 6	353 ± 17**	19.5 ± 2.1**	456 ± 24*
20 ПДК БП	30 ± 7*	54 ± 8*	4.7 ± 0.5	88 ± 16*

Примечание. Различия с контролем достоверны при * р < 0.05, ** р < 0.01.

увеличивается по мере возрастания концентрации БП с 1.6 (контроль) до 5.4 % (20 ПДК БП). Увеличение вклада аммонификаторов в структуру популяции микроорганизмов с

18.3 (10 ПДК) до 33.9 % (20 ПДК) связано не с возрастанием их численности, а с резким сокращением численности азотфиксаторов в этих вариантах.

Таблица 2. Структура популяции почвенной микробиоты, (%)

Вариант	Аммонификаторы	Азотфиксаторы	Грибы
Контроль	56.3	42.1	1.6
10 ПДК БП	18.3	77.4	4.3
20 ПДК БП	33.9	60.7	5.4

В табл. 3 представлены значения индексов токсичности ( Т ), определенные по реакции простейших P. caudatum и бактерий E. coli (тест-система «Эколюм») на почву без внесения и с внесением БП. Отмечено, что внесение БП в концентрации 10 ПДК не оказывает острого токсического действия на используемые биотесты. Значения Т для контрольного образца и образца 10 ПДК БП совпадают.

Таблица 3. Результаты определения острой токсичности образцов почв, загрязненных бенз[а]пи-реном, по реакции простейших Paramecium caudatum и бактериальной тест-системы «Эколюм»

Вариант	Индекс токсичности ( Т ), степень токсичности
	Paramecium caudatum	Тест-система «Эколюм»
Контроль	0.19 ± 0.12, I группа, допустимая степень токсичности	0, I группа, образец не токсичен
10 ПДК БП	0.19 ± 0.11, I группа, допустимая степень токсичности	0, I группа, образец не токсичен
20 ПДК БП	0.34 ± 0.20, I группа, допустимая степень токсичности	29 ± 9, II группа, образец токсичен

Обсуждение

Рост является интегральным показателем состояния растений. При проведении модельного эксперимента установлено, что БП не оказывал влияния на всхожесть семян кресс-салата, что, вероятно, обусловлено низкой проницаемостью семенной кожуры для поллютанта. Кроме того, в период прорастания питание проростка происходит в большей степени благодаря семени, а не за счет питательных веществ почвы. Вероятно, по этой причине изменений ростовых параметров 10-суточных растений кресс-салата в присутствии БП в почве нами не выявлено (см. рис. 1). Тем не менее при высокой дозе БП в почве (20 ПДК) отмечали снижение накопления сырой биомассы корнями проростков (см. рис. 2).

В фазе проростка высшее растение достаточно чувствительно к действию стресс-факторов. Уровень окислительного стресса можно оценивать по накоплению МДА в тканях растений. При внесении БП в почву установлено повышенное относительно контроля содержание МДА в побегах кресс-салата (см. рис. 3), что может свидетельствовать об интенсификации процессов ПОЛ в клетках в условиях окислительного стресса, вызванного наличием БП в почве.

Почва с содержанием 20 ПДК БП оказывает токсическое действие на тест-систему «Эко-люм». Индекс токсичности, определенный по реакции P. caudatum , для варианта опыта при дозе 20 ПДК БП был в 1.8 раза выше, чем для контрольного варианта и 10 ПДК БП, но не превышал значений для допустимой степени токсичности ( Т < 0.40).

Известно, что БП обладает способностью усиливать рост и размножение ряда растений (Бигалиев и др., 2009). Впервые это было показано на водоросли Obelia geniculata (Шабад, 1973). С тех пор многочисленными исследованиями подтверждено, что в малых концентрациях БП обладает ростстимулирующим действием. В работе (Скугорева и др., 2021а) при внесении в почву небольшой дозы БП (2 ПДК) отмечали ростстимулирующий эффект БП. При более высоких концентрациях БП возможны процессы торможения роста и развития растений.

Микроорганизмы являются первой мишенью действия токсиканта на почвенную экосистему. В исследуемых концентрациях БП оказывал очень сильное воздействие, в первую очередь, на численность прокариотных микроорганизмов (см. табл. 1). Наиболее чувствительными к действию БП были аммонификаторы. При этом чем выше была доза БП, тем меньше в почве аммонификаторов: коэффициент корреляции между их численностью в почве и концентрацией БП составил -0.995. Подобный эффект был отмечен нами ранее (Скугорева и др., 2021а). Резкое отрицательное воздействие БП на численность почвенных аммонификаторов может приводить к снижению активности минерализационных процессов. Угнетение азотфиксаторов происходило только при высокой концентрации БП (20 ПДК), в то же время этот поллютант стимулировал размножение данной группы бактерий при концентрации 10 ПДК. Совершенно иная реакция наблюдается для грибов: отсутствие угнетения при самой высокой дозе БП и стимуляция их размножения при 10 ПДК. Полученные данные хорошо коррелируют с результатами, приведенными в работе (Опе-кунова, 2016), согласно которым при содержании 2 ПДК БП проявляется токсическое действие на сапрофитные микроорганизмы, количество которых значительно снижается, и на грибы, количество которых в почве резко возрастает.

При действии БП изменялась не только численность микроорганизмов, но структура популяций микробного сообщества почвы (см. табл. 2). Если для контрольного варианта характерно преобладание аммонификаторов, то для вариантов с БП – азот-фиксаторов.

Согласно результатам биотестирования (см. табл. 3), внесение в почву 10 ПДК БП практически не оказывало токсического действия на P. caudatum и тест-систему «Эколюм». При более высокой концентрации БП (20 ПДК) отмечено токсическое действие на тест-систему «Эколюм», т. е. данная тест-система является более чувствительной к загрязнению почв БП, чем простейшие P. caudatum . Данный факт, вероятно, связан с тем, что кишечная палочка E. coli , входящая в основу тест-системы «Эколюм», относится к группе аммонификаторов, численность которых резко снижается при действии данного токсиканта. В то же время ранее нами было отмечено, что P. caudatum является чувствительным тест-организмом к загрязнению БП городских почв (Скугорева и др., 2021б).