Оценка ультраструктурных изменений ассоциации микроорганизмов, участвующих в возникновении и распространении болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота, под воздействием комплексного средства «СВ»
Автор: Тарасова Е.Ю., Хузин Д.А., Саитов В.Р., Потехина Р.М., Кашеваров Г.С., Юсупов С.А., Быкова П.В.
Статья в выпуске: 3 т.259, 2024 года.
Бесплатный доступ
Цель исследования заключалась в оценке ультраструктурных изменений ассоциации микроорганизмов (потенциальных возбудителей болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота) под воздействием нового комплексного средства «СВ» для сухих копытных ванн. При морфологическом исследовании микроорганизмов на ультраструктурном уровне при воздействии разработанного средства показано, что «СВ» обладает бактерицидными и фунгицидными свойствами, выражающимися просветлением электронной плотности срезов микроорганизмов, нарушением конфигурации бактериальных клеток, увеличением перинуклеарного пространства, вплоть до проявления полных деструктивных процессов. Результаты исследования свидетельствуют о возможности внедрения средства «СВ», разработанного в ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», при проведении лечебно-профилактических мероприятий в сельхозпредприятиях, неблагополучных по болезням пальцев и копытец крупного рогатого скота.
Сухая копытная ванна, микст-инфекция, ультратонкие срезы, микроорганизм, клеточная стенка, электронная плотность, деструкция, морфометрия
Короткий адрес: https://sciup.org/142242493
IDR: 142242493 | УДК: 57.012.4:57.021:573.4:636.2 | DOI: 10.31588/2413_4201_1883_3_259_237
Assessment of ultrastructural changes in the association of microorganisms involved in the appearance and distribution of diseases of the fingers and hooves of cattle under the influence of complex agent "SV"
The purpose of the study was to evaluate ultrastructural changes in the association of microorganisms (potential pathogens of diseases of the fingers and hooves of cattle) under the influence of a new complex product “SV” for dry hoof baths. A morphological study of microorganisms at the ultrastructural level under the influence of the developed product showed that “SV” has bactericidal and fungicidal properties, expressed by clearing the electron density of microorganism sections, disrupting the configuration of bacterial cells, increasing the perinuclear space, up to the complete destructive processes showing. The results of the study indicate the possibility of introducing the “SV” product, developed at the FSBSI «FCTRBS-ARRVI», when carrying out therapeutic and preventive measures in agricultural enterprises affected by diseases of the fingers and hooves of cattle.
Текст научной статьи Оценка ультраструктурных изменений ассоциации микроорганизмов, участвующих в возникновении и распространении болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота, под воздействием комплексного средства «СВ»
Разработка новых антимикробных средств, обладающих эффективностью в отношение ассоциации потенциальных возбудителей, вызывающих болезни пальцев и копытец крупного рогатого скота, имеет важное научно-практическое значение [1-3, 5].
Немаловажную роль в оценке антимикробного воздействия играют морфологические и особенно электронномикроскопические исследования, позволяющие четко визуализировать ультраструктурное состояние и степень влияния тех или иных реагентов [6].
Мероприятия, направленные на разрыв путей передачи возбудителей инфекционного процесса во внешней среде, в частности с использованием копытных ванн, являются наиболее действенным и общедоступным способом предупреждения возникновения и распространения инфекций у продуктивных животных, что особенно актуально в условиях высокой концентрации животных на ограниченных площадях молочных комплексов [7-12].
Критическое действие биоцида характеризуется полной деструкцией генетического аппарата микроорганизмов и, как следствие их гибелью, при этом важно щадящее действие таких средств на ткани макроорганизма для сохранения их жизнеспособности [4, 14, 15].
В связи с этим, изучение ультраструктуры микроорганизмов, участвующих в патологии дистального отдела конечностей, целенаправленно подвергшихся воздействию различных биоцидных средств, позволяющее объективно документировать степень деструкции микроорганизмов является весьма актуальной задачей.
Цель исследования заключалась в оценке ультраструктурных изменений ассоциации микроорганизмов (потенциальных возбудителей болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота) под воздействием нового комплексного средства «СВ» для сухих копытных ванн. В состав, разработанного в ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», средства «СВ» входят активно действующие вещества, обладающие выраженными фунгицидными, бактерицидными, адсорбционными и противовоспалительными свойствами (соли меди и цинка, поливиниловый спирт, бензолсульфохлорамид натрия, неорганические адсорбенты).
Материал и методы исследований. Объектами исследования являлись разработанное в ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» средство «СВ» для групповой профилактики и лечения болезней дистального отдела конечностей крупного рогатого скота методом сухих копытных ванн, суточные культуры тест-микроорганизмов ( E. coli М-17, S. aureus
209 Р, S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ВОЗ, Cl. perfringens АТСС 13124, C. albicans АТСС 10231) и выделенных изолятов (Streptococcus spp., Proteus spp.), выращенных на соответствующих питательных средах.
Для проведения морфологических исследований на ультраструктурном уровне при воздействии «СВ» культуры суспендировали посредством изотонического раствора до достижения 2×109 клеток в 1 см3. Эффективность «СВ» изучали в различных концентрациях и экспозициях с исходными штаммами. Затем проводили центрифугирование при 5000 об/мин в течение 15 минут. Осадки культур дважды отмывали изотоническим раствором.
Электронно-микроскопические исследования выполнялись согласно методике получения ультратонких срезов [5]. Для расчета площади бактериальных клеток на откалиброванных микрофотографиях использовали морфометрическую программу с открытым исходным кодом FIJI–ImageJ [13]. Средние значения показателей вычисляли в программе MS Excel.
Результат исследований. Ранее нами было изучено влияние средства «СВ» на тест-штамм F. necrophorum 8TS630501 [6]. В данный эксперимент включены микроорганизмы, которые в естественных условиях могут являться потенциальными возбудителями, участвующими в возникновении и распространении болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота. Среди них имеются кокковые и палочковидные формы, грамположительные, грамотрицательные бактерии, аэробы, анаэробы, факультативные анаэробы и микроскопические грибы (Таблица 1).
Таблица 1 – Микроорганизмы в отношении которых определяли эффективность «СВ»
|
№ п/п |
Название микроорганизма |
Характеристика |
|
1 |
S. aureus |
Грамположительные, факультативные анаэробы, кокки |
|
2 |
Streptococcus spp. |
Грамположительные, факультативные анаэробы, кокки |
|
3 |
Cl. perfringens |
Грамположительные, анаэробы |
|
4 |
E. coli |
Грамотрицательные, аэробы, факультативные анаэробы |
|
5 |
S. enterica |
Грамотрицательные, аэробы |
|
6 |
Proteus spp. |
Грамотрицательные, анаэробы |
|
7 |
C. albicans |
Диплоидный грибок |
На ультратонких срезах бактериальные клетки и микроскопические грибы групп биологического контроля ( S. aureus , Streptococcus spp., Cl. perfringens , E. coli , S. enterica , Proteus spp. и C. albicans ) имеют субмикроскопические признаки, характерные для их нативного состояния.
Кокковые, грамположительные формы S. aureus и Streptococcus spp. округлой конфигурации (Рисунок 1.1), площадью сечения в среднем от 0,39 до 0,47 мкм. Клеточная стенка относительно ровная, под ней располагается относительно ровная цитоплазматическая мембрана, плотно прилегающая к внутреннему слою клеточной стенки и, вместе с тем, тесно связанная с цитоплазмой. На микрофотографиях хорошо просматривается гомогенный плотный слой муреина (пептигликанов) у стафилококков, его толщина в среднем составляет 86,1 нм, стрептококков – 52,1 нм. Важной особенностью ультраструктуры цитоплазмы грамположительных S. aureus и Streptococcus spp. является высокая электронная плотность содержимого, более плотная, чем у рассматриваемых нами грамотрицательных бактерий. Нити ДНК в зоне электронно-плотного вещества не просматриваются.
Грамположительные, споровые, анаэробные Cl. perfringens, крупные веретенообразной формы, ширина (0,8–4,2 мкм), длина до 8 мкм. Клеточная стенка имеет экзоспориум и кортекс (Рисунок 2.5). Центральная часть эндоспоры – это сердцевина или спороплазма.
Грамотрицательные аэробы и анаэробы – E. coli , S. enterica и Proteus spp., палочковидной (Рисунки 1.3, 1.5, 2.3), в том числе округлой формы, в длину от 0,8 до 4,9 мкм, в ширину от 0,3 до 0,8 мкм. На электронограммах хорошо визуализируется извилистая многослойная клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана, окружающие бактериальные клетки, характерные для грамотрицательных микроорганизмов. Ультраструктура цитоплазмы E. coli , S. enterica и Proteus spp., характеризуется средней и достаточно высокой электронной плотностью. В центральной части ряда бактерий иногда просматривается нуклеоид.
Интактные диплоидные микроскопические грибы C. albicans на ультратонких срезах имеют овальноокруглую форму (Рисунок 2.1), площадью сечения в среднем 54,3 нм. Клеточная стенка в среднем толщиной 0,05 мкм, ровная, гомогенной структуры, средней электронной плотности. Цитоплазма плотной консистенции, ядро в центральной части, округлой формы с неправильными границами. Цитоплазма клеток C. albicans содержит крупную вакуоль (Рисунок 2.1) с электронноплотным содержимым, от 3 до 4-х липидных капель, митохондрии с плотным матриксом и пластинчатыми кристами, пероксисомы и отдельные цистерны эндоплазматической сети.
Рисунок 1 – Staphylococcus aureus, E. coli, Salmonella enterica – нативные клетки (1, 3, 5), клетки при воздействии «СВ» (2, 4, 6) . Условные обозначения: В – включения цитоплазмы, ВЗ – везикулы внешней мембраны, ДК – дефекты клеток, КС – клеточная стенка, Н – нуклеоид, ПП – периплазматическое пространство, ЦМ – цитоплазматическая мембрана, ЦП – цитоплазма, ЦПМ – цитоплазматическая мембрана
Бактериальные клетки и микроскопические грибы опытных групп ( S. aureus , Streptococcus spp., Cl. perfringens , E. coli , S. enterica , Proteus spp. и C. albicans ) после воздействия «СВ», претерпевают определенные изменения на субмикроскопическом уровне.
Кокковые, грамположительные формы S. aureus и Streptococcus spp. после применения «СВ» в дозах 2,0 и 4,0 % и экспозициях 30 и 60 минут в целом имеют округло-овальную форму (Рисунок 1.2). В сравнении с контрольными штаммами отмечается незначительное уменьшение размеров площади сечения от 0,38 до 0,43 мкм. На микрофотографиях наблюдается деструкция клеточных стенок с потерей содержимого. Бактерии на срезах становятся менее электронно-плотными, нуклеоид не просматривается.
Грамположительные, споровые, анаэробные Cl. perfringens, после воздействия «СВ» в дозах 8,0 и 10,0 % и экспозициях 1 и 4 часа претерпевают поэтапную деформацию и деструкцию всех слоев спор (Рисунок 2.6). Экзоспориум прогибается или выгибается, после чего идет разрыв и действие СВ на последующие слои споры. Цитоплазма (спороплазма) проявлению уплотняется (уменьшается) и просветляется (Рисунок 2.6). Грамотрицательные аэробы и анаэробы ( E. coli , S. enterica и Proteus spp.), после применения «СВ» в дозах 1,0, 2,0, 4,0 % и экспозициях 30 и 60 минут палочковидной и овальной формы, редко округлой. Размеры несколько меньшие, чем в группах биологического контроля – в длину от 0,8 до 4,9 мкм, в ширину от 0,3 до 0,8 мкм. В клеточной стенке и плазматической мембране отмечается изменение конфигурации, в виде неровностей, углублений (Рисунки 1.4, 1.6, 2.4). Увеличивается периплазматическое пространство, иногда занимающее большую площадь, чем цитоплазма.
Бактериальные клетки имеют меньшую электронную плотность цитоплазмы, чем в группе контроля. В центральной части ряда бактерий цитоплазма становится электронно-прозрачной с видимыми нитями нуклеоида. После воздействия «СВ» на ультраструктуру C. albicans в дозах 1,0, 2,0 % и экспозициях 60 и 180 минут нарушается правильность овальноокруглого строения клеток, размеры клеток не изменяются (площадь сечения в среднем 54,3 нм). Нарушается ровность клеточной стенки (Рисунок 2.2) на всем протяжении и ее гомогенность, при этом она в сравнении с контролем утолщается до 0,11 мкм. Цитоплазма ближе к центру сохраняет плотную консистенцию, но по периферии появляются участки ее просветления. Ядро хорошо видно в центральной зоне, митохондрии определяются с трудом, остальные органоиды не визуализируются. В целом отмечаются деструктивные процессы – хаотичное расположение по периферии фрагментов (обломков) содержимого цитоплазмы.
Рисунок 2 – C. albicans, Proteus spp. , Cl. perfringens – нативные клетки (1, 3, 5) ; экспериментальные клетки (2, 4, 6). Условные обозначения : В – включения цитоплазмы, ВАК – вакуоль, ДК – дефекты клеток, КС – клеточная стенка, ЛВ – липидные включения, МХ – митохондрии, ПП – периплазматическое пространство, ПС – пероксисомы, ЦП – цитоплазма, Э – экзоспориум, ЭЦП – экзоспориальная цитоплазма, Я – ядро
Заключение. При морфологическом исследовании микроорганизмов, участвующих в возникновении болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота, на ультраструктурном уровне при воздействии разработанного средства, показано, что «СВ» обладает выраженными бактерицидными и фунгицидными свойствами, выражающимися просветлением электронной плотности срезов микроорганизмов, нарушением конфигурации бактериальных клеток, увеличением перинуклеарного пространства, вплоть до проявления полных деструктивных процессов.
Список литературы Оценка ультраструктурных изменений ассоциации микроорганизмов, участвующих в возникновении и распространении болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота, под воздействием комплексного средства «СВ»
- Анализ рынка дезинфицирующих средств, используемых в отдельных животноводческих хозяйствах Приволжского федерального округа / Е. Ю. Тарасова, А. М. Тремасова, Д. А. Хузин [и др.] // Ветеринарный врач. – 2022. – № 3. – С. 58-66.
- Антимикробная активность экспериментальных образцов средства для сухих ножных ванн / Е. Ю. Тарасова, Р. М. Потехина, Д. А. Хузин [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. – 2023. – Т. 256. – № 4. – С. 254–259.
- Болезни пальцев и копытец у коров, их профилактика и лечение / Д. А. Хузин, Т. Р. Гайнутдинов, Ф. А. Хусниев [и др.] // Ветеринарный врач. – 2014. – № 5. – С. 24-29.
- Изучение антимикробной активности новых дезинфицирующих средств из группы четвертичных аммониевых соединений / Ф. М. Нехайчик, Д. Н. Мингалеев, Л. Е. Матросова [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. – 2020. – Т. 244. – № 4. – С. 134-138.
- Методические рекомендации по электронно-микроскопическим исследованиям биологических объектов / А. В. Иванов, А. А. Иванов, А. Н. Чернов [и др.]. – Казань: ФГБНУ «Росинформагротех», 2011. – 67 с.
- Оценка ультраструктурных изменений Fusobacterium necrophorum под воздействием средств, применяемых для групповой профилактики болезней дистального отдела конечностей копытных животных / К. В. Перфилова, Г. С. Кашеваров, В. Р. Саитов [и др.] // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. – 2023. – № 1. – С. 153-158.
- Плесневые грибы и пиогенные бактерии – причины болезней пальцев и копытец у коров / Р. М. Потехина, Д. А. Хузин, В. Ю. Титова [и др.] // Ветеринарный врач. – 2021. – № 2. – С. 44-49.
- Профилактическая эффективность различных средств и методов лечения некротических поражений копытец крупного рогатого скота / Х. Н. Макаев, Д. А. Хузин, Р. М. Потехина, Н. А. Мухамметшин // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. – 2012. – Т. 209. – С. 202-206.
- Роль сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов в возникновении и распространении оппортунистических инфекций крупного рогатого скота / Д. А. Хузин, С. А. Юсупов, А. И. Ерошин [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. – 2022. – Т. 252. – № 4. – С. 267-272.
- Экспериментальный сочетанный микотоксикоз свиней на фоне инфекционной нагрузки / Э. И. Семенов, Л. Е. Матросова, С. А. Танасева [и др.] // Сельскохозяйственная биология. – 2022. – Т. 57. – № 2. – С. 371-383.
- Этиология, патогенез и меры борьбы с некробактериозом крупного рогатого скота / Д. А. Хузин, Х. Н. Макаев, Ф. А. Хусниев [и др.] // Ветеринарный врач. – 2010. – № 5. – С. 49-51.
- Эффективность препаратов для ножных ванн при поражениях копытец крупного рогатого скота / А. А. Сидорчук, Ю. В. Белкина, А. В. Пчельников // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, биотехнологии и морфологии: сборник трудов Национальной научно-практической конференции. – Кинель: Самарский ГАУ, 2021. – С. 168-172.
- Fiji: an open-source platform for biological-image analysis / J. Schindelin, I. Arganda-Carreras, E. Frise [et al.] // Nature methods. – 2012. – Vol. 9. – No 7. – P. 676–682.
- Metabolite-associated enzymatic properties of microorganisms with an antagonistic effect on Aspergillus and Fusarium fungi, pathogenic for crops and farm animals / S. R. Khabirova, I. I. Idiyatov, E. A. Shuralev, A. M. Tremasova // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. – 2021. – Т. 723. – P. 022022.
- The ABC-Type Efflux Pump MacAB is involved in protection of Serratia marcescens against aminoglycoside antibiotics, polymyxins, and oxidative Stress / T. V. Shirshikova, L. K. Kamaletdinova, L. E. Matrosova [et al.] // mSphere. – 2021. – Vol. 6. – № 2. – P. 1-16.
