Оценка влияния пробиотической бактерии Streptococcus salivarius на микробиом кишечника людей с ожирением

Ключевую роль в поддержании здорового функционирования кишечного микробиома отводят видовому разнообразию микроорганизмов внутри кишечной популяции [1]. Микробный баланс приводит к формированию, так называемого, кишечного барьера, защищающего организм от внешних и внутренних воздействий. Снижение разнообразия микроорганизмов и доминирование патогенной микрофлоры над полезной становится причиной кишечного дисбактериоза [2,3].

Ранее была проведена работа по поиску корреляции между микробным составом кишечного тракта и развитием различных метаболических нарушений. Так, при секвенировании гена 16S рРНК было установлено, что в исследуемых группах с ожирением и сахарным диабетом 2 типа по сравнению с контрольной здоровой группой зарегистрировано снижение численности представителей рода Streptococcus [4]. Помимо этого, выявлена прямая связь между долей Streptococcus и показателем индекса массы тела. Было установлено, что штамм Streptococcus salivarius subsp. thermophiles вносит значительный вклад в поддержание массы тела пациентов с различными метаболическими нарушениями, что способствует его к рассмотрению в качестве пробиотика [4].При этом в обзоре, посвященном изучению актуальной научно-исследовательской литературы в области изучения состава кишечного микробиома при диагностированном сахарном диабете 2 типа и преддиабетических состояниях было установлено, напротив, увеличение филума Firmicutes в том числе и представителей рода Streptococcus [5].

В работе, посвященной изучения взаимосвязи между пародонтитом и сахарным диабетом 2 типа, было установлено, что у пациентов с сахарным диабетом и прогрессирующем пародонтозом наблюдается снижение Streptococcus , что приводит к снижению синтеза бутирата, а это в свою очередь приводит к усугублению тяжести проявления сахарного диабета 2 типа [6]. Результаты исследований микробного состава кишечного микробиома у беременных женщин с сахарным диабетом 2 типа продемонстрировали значительно снижение количества представителей рода Streptococcus по сравнению со здоровой контрольной группой [7].

Материалы и методы

В исследовании приняли участие добровольцы с ожирением и диабетом 2 типа (n = 6). Перед началом эксперимента добровольцы проходили анкетирование, содержащие перечень вопросов: возраст, рацион питания, физическая активность, анамнез как инфекционных, так и неинфекционных заболеваний, терапия лекарственными препаратами, в том числе гормональных и антибактериальных (за последние 6 месяцев). Средний возраст группы составил 40 лет, а средний индекс массы тела 35,7.

На первом этапе исследования у добровольцев, вошедших в исследуемую группу, был собран кал (не менее 1 грамма). Затем без изменений привычного рациона питания, в течение двух недель один раз в день после еды они принимали пробиотическую добавку, в основе которой был Streptococcus salivarius 1,0 • 10⁹ КОЕ. После окончания двухнедельного приёма добавки, у добровольцев также был собран кал для дальнейших молекулярно-генетических исследований.

Экстракцию тотальной ДНК из кала производили с использованием набора МетаГен/ MetaGen (Синтол, Россия).

Оценку количество полученной ДНК, проводили с использованием флуориметра Qubit 2.0 (Thermo Fisher, США) и набора Equalbit 1х dsDNА HS Assay Kit (Vazyme, Китай). Также была определена чистота и наличие примесей в образцах с помощью спектрофотометра Nano-500 (Allsheng, Китай) согласно инструкции производителя).

Подготовка библиотек для секвенирования проводилась с использованием коммерческих наборов реагентов MGI (MGI, Китай) согласно протоколам производителя. На первом этапе полученная тотальная ДНК подвергалась фрагментации, а затем к полученным фрагментам были прикреплены специальные адаптеры, содержащих уникальные штрихкоды.

Для оценки качества и концентрации продуктов на каждом этапе применялись электрофорез в 2 % агарозном геле и флуориметрия. Для этого использовались приборы Qubit 2.0 (Thermo Fisher, США) и Nano-500 (Hangzhou Allsheng Instruments Co., Ltd. Китай) в сочетании со специализированными наборами Equalbit 1х dsDNА HS Assay Kit (Vazyme, Китай) и QuDye ssDNА Assay Kit (Lumiprobe, Россия) для количественного определения дву- и одноцепочечной ДНК.

После количественной оценки, амплифи-цированные продукты были сгруппированы в пулы. Затем, для создания одноцепочечных ДНК-библиотек, эти пулы прошли процесс циркуляризации. После финального контроля качества, рассчитанные объемы отдельных пулов были смешаны в единый супер-пул с конечной концентрацией, соответствующей 60 фмоль.

Для секвенирования на приборе DNBSEQ-G50 (MGI, Китай) были подготовлены ДНК-наноболы (ДНБ) с помощью рекомендованного производителем набора. Их концентрация была определена флуорометрически. Затем ДНБ были загружены в проточную ячейку секвенатора вместе с реагентами

Статистический анализ проводился в среде R (версия 4.5.1). Альфа-разнообразие оценивалось по индексу Шеннона, а бета-разнообразие – по метрике Брея-Кертиса. Для сравнения альфа-разнообразия между группами использовался непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия в разнообразии между группами оценивались с помощью функции ADONIS. Относительная численность бактериальных видов сравнивалась между группами с помощью метода ANCOMBC (версия 2.11.1) с коррекцией Холма.

Статистически значимыми считались результаты с p-значением ≤ 0,05 после коррекции. Данные представлены в виде средних значений с указанием стандартного отклонения (SD).

Результаты

Анализ фекального микробиома добровольцев до и после приема пробиотической добавки, позволил идентифицировать 10 типов, 102 класса, 108 порядков, 129 семейств, 300 родов и 448 видов бактерий. Также был выявлен один тип из царства Археи Methanobacteriota с видовым представителем Methanobrevibacter smithii . Типы, численность которых была меньше 1 %, были объединены в «Другие» (рисунок 1) .

Рисунок 1. Типы бактерий, обнаруженные в фекальном микробиоме исследуемых групп

Figure 1. Bacterial types found in the fecal microbiome of the study groups

Также был проведен анализ альфа-разнообразия, используя меры разнообразия наблюдаемых видов и индекс Шеннона (рисунок 2). Статистически значимых различий не выявлено.

Рисунок 2. Альфа-разнообразие кишечного микробиома пациентов до и после приема пищевой добавки

Figure 2. Alpha diversity of the gut microbiome of patients before and after taking a dietary supplement

Анализ бета-разнообразия показал наличие кластеризации между исследуемыми группами, однако, статистически достоверных различий не обнаружено (рисунок 3).

Рисунок 3. График анализа основных координат (РСоА) бета-разнообразия на основе шкалы Брея – Кертиса между исследуемыми группами

Figure 3. Principal coordinates analysis (РСоА) plot of beta diversity based on the Bray-Curtis scale between study groups

Дифференциальный анализ численности выявил статистически значимые различия на видовом уровне между микробиомом добровольцев до и после приема пищевой добавки. Таким образом, у пациентов после приема добавки мы наблюдали снижение содержания видов: Phocaeicola vulgatus (8,469 % ± 2,884 против 3,460 % ± 0,864, p = 0,013), Yeguia hominis (0,017 % ± 0,005 против 0,007 % ± 0,004, p = 0,017). Напротив, относительная обильность вида GGB2970 SGB3952 (Firmicutes) увеличивалась на фоне приема пробиотической добавки относительно данных полученных изначально до добавки (0,043 % ± 0,012 против 0,087 % ± 0,009, p = 0,001) (рисунок 5).

Рисунок 4. Различия в составе кишечного микробиома пациентов до и после приема пищевой добавки. • p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01

Figure 4. Differences in the composition of the intestinal microbiome of patients before and after taking the dietary supplement. • p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01

Обсуждение

После приема пробиотической добавки, содержащей бактериальную культуру S. salivarius , наблюдалось снижение численности автохтонного представителя кишечного тракта человека Phocaeicola vulgatus . Известны результаты исследований, в которых данный вид демонстрирует высокий пробиотический потенциал [8]. Было установлено, что включение в диету пробиотика P. vulgatus смягчает симптомы развития метаболической дисфункции, ассоциированной со стеатозом печени [9]. Данный позитивный эффект объясняется способностью P. vulgatus синтезировать 3-гидроксифенилацетиловую кислоту, которая снижает уровень ацетилирования Н3К27 и подавляет транскрипцию скваленэпоксидазы, что приводит к накоплению липидов в печени [10]. Однако, у пациентов с диагностированным язвенным колитом выявлена, напротив, прямая связь между количеством P. vulgatus и тяжестью течения заболевания. Данный тератогенный эффект объясняется способностью P. vulgatus принимать участие в избыточной секреции протеаз, которые индуцируют патогенез язвенного колита [11,12]. В связи с этим, можно говорить о том, что прием пробиотика, содержащего S. salivarius , возможно использовать в профилактических целях развития язвенного колита за счет подавления избыточного роста P. vulgatus в кишечнике. Однако, для валидации такой работы необходимы дальнейшие исследования.

Аналогичные результаты были получены и для бактерии Yeguia hominis . После приема пробиотика наблюдалось снижение численности Y. hominis в кишечном тракте. Идентифицированный вид является новым и был описан недавно, он принадлежит к семейству Acutalibacteraceae и является компонентом нормофлоры кишечника человека [13].

Прием пробиотического препарата, содержащего S. salivarius, привел к значительному росту представителей Firmicutes GGB2970 SGB3952 в кишечном микробиоме человека [14]. Известно, что филум Firmicutes включает в свой состав большое разнообразие бактерий, которые являются яркими представителями кишечной микрофлоры человека. Используемый в исследовании полезный пробиотический штамм S. salivarius относится к типу Firmicutes [15]. Вероятно, рост численности представителей Firmicutes относительно контрольной группы связан с приемом пробиотической культуры S. salivarius. Однако необходимо учитывать соотношение таксонов Firmicutes/Bacteroidetes в кишечном микробиоме, так как их дисбаланс может приводить к развитию различных патологий [16, 17]. Известны исследования, в которых рост численности представителей Firmicutes относительно типа Bacteroidetes в кишечном микробиоме коррелировал с развитием ожирения [18-20].

Снижение относительной представленности Phocaeicola vulgatus и Yeguia hominis при увеличении GGВ2970 SGВ3952 указывает на направленное изменение таксономического профиля микробиоты. Направление сдвигов можно охарактеризовать как потенциально благоприятное. Однако физиологическая значимость этих сдвигов требует дальнейшего изучения, включая анализ функционального потенциала микробиоты и ассоциаций с клиническими параметрами.

Заключение

Сравнительный анализ микробиомов до и после приема S. salivarius добровольцами продемонстрировал, что общие показатели структуры микробного профиля масштабных изменений не претерпели: статистически значимых различий по альфа-разнообразию и бета-разнообразию не установлено. После приема S. salivarius отмечалось статистически значимое снижение относительной обильности Phocaeicola vulgatus и Yeguia hominis . Напротив, наблюдалось увеличение относительной обильности вида GGB2970 SGB3952 типа Firmicutes. Направление сдвигов можно охарактеризовать как потенциально благоприятное. Однако физиологическая значимость изменений в составе кишечного микробиома требует дальнейшего изучения.

Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект FZGW-2024–0003).