Олигонуклеотидные адъюванты в вакцинологии: современная классификация, механизмы действия и тенденции развития

EDN:

O. V. Kraineva a,b, N. A. Besedina a *, I. V. Sergeev b, A. Yu. Savchenko a a National Research Nuclear University MEPhI, Moscow, Russian Federation,

Современная вакцинология сталкивается с необходимостью создания препаратов, способных индуцировать не только гуморальный, но и клеточный иммунный ответ. Это особенно важно для защиты от внутриклеточных патогенов (вирусы, некоторые бактерии), а также для создания терапевтических противораковых вакцин. Однако высокоочищенные рекомбинантные и субъединичные антигены, составляющие основу большинства современных вакцин, сами по себе обладают слабой иммуногенностью и требуют использования адъювантов – веществ, усиливающих и направляющих иммунный ответ [1; 2].

Традиционные адъюванты, такие как соли алюминия, применяемые в вакцинах с 1930-х гг., эффективно стимулируют гуморальный иммунитет, но практически не активируют Т-клеточ-ное звено [1; 2]. Эмульсии типа MF59 и AS03, а также липосомальные системы доставки позволяют частично решить эту проблему, однако их действие остается относительно широким и не всегда обеспечивает необходимую направленность иммунного ответа [2; 3; 4]. Липосомы и виросомы, доказавшие свою эффективность в составе мРНК-вакцин против COVID-19, представляют собой прежде всего системы доставки, а не программируемые активаторы иммунитета [2; 5; 6].

В последние десятилетия особое внимание исследователей привлекают микробные и синтетические иммуностимуляторы – вещества, имитирующие структуру компонентов патогенов и воздействующие на специфические рецепторы врожденного иммунитета [7]. Наиболее перспективными среди них являются CpG-олигонуклеотиды (CpG ODN) – синтетические аналоги бактериальной ДНК, содержащие неметилированные цитозин-фосфат-гуаниновые мотивы [7; 8; 9].

В геноме млекопитающих такие последовательности встречаются редко и, как правило, в метилированном виде, тогда как в бактериальной ДНК неметилированные CpG-мотивы присутствуют часто. Благодаря этому иммунная система позвоночных распознает CpG ODN как сигнал опасности, имитирующий вторжение патогенов [10; 11]. CpG ODN являются агонистами Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), который экспрессируется в клетках врожденного иммунитета – плазмацитоидных дендритных клетках, В-лимфоцитах, макрофагах и моноцитах [11; 12]. Активация TLR9 запускает каскад сигнальных путей, ведущих к выработке интерферонов I типа и провоспалительных цитокинов, что в итоге формирует сбалансированный иммунный ответ с преобладанием Th1-компо-нента (T-хелперы 1 типа) [8; 10; 12].

Клиническая значимость CpG-адъювантов подтверждена одобрением препарата CpG 1018 в составе вакцины против гепатита В (HEPLISAV-B®), где он продемонстрировал более быстрое развитие и более высокие титры защитных антител по сравнению с традиционными адъювантами, особенно у пациентов с ослабленным иммунным ответом [9; 13; 14]. В ходе пандемии COVID-19 были разработаны и одобрены вакцины SCB-2019 (с CpG 1018) и SpikoGen® (с Advax-CpG55.2) [7; 10; 15]. Активно исследуется применение CpG ODN в составе противораковых вакцин для перепрограммирования опухоль-ассоциирован-ных макрофагов [16; 17].

Несмотря на впечатляющие успехи, данные о классификации CpG ODN, тонких механизмах их действия, подходах к химической модификации и системах доставки остаются фрагментарными и требуют систематизации. Существующие обзоры часто фокусируются либо на иммунологических аспектах, либо на клиническом применении, не давая целостной картины, объединяющей структурное разнообразие CpG ODN с их функциональными характеристиками и технологическими решениями для преодоления ограничений.

Цель обзора – систематизация современных данных о CpG-олигонуклеотидных адъювантах, их структурно-функциональных характеристиках, классификации, молекулярных механизмах TLR9-опосредованной активации, ключевых химических модификациях, а также анализ стратегий доставки и клинического применения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведен систематический анализ современной научной литературы, посвященной олигонуклеотидным адъювантам, их классификации, механизмам TLR9-опосредованной активации иммунитета, химическим модификациям и стратегиям направленной доставки.

Источники информации. Поиск литературных источников осуществлялся в базах данных PubMed, PubMed Central и eLibrary. Глубина поиска составила 20 лет, что позволило охватить как фундаментальные работы по CpG-иммуностимуляции, опубликованные с 2005 г., так и актуальные исследования последних 5–7 лет. Основной массив проанализированных работ охватывает период 2013–2026 гг., отражающий современные тенденции развития технологий доставки и клинического применения.

Стратегия поиска. Для поиска использовались следующие ключевые слова и их комбинации на русском и английском языках: CpG-олигонуклеотиды, TLR9 агонисты, адъюванты для вакцин, фосфоротиоатные модификации, системы доставки, липосомы, наночастицы, CpG oligonucleotides, TLR9 agonists, vaccine adjuvants, phosphorothioate modification, delivery systems, liposomes, nanoparticles.

Критерии отбора. В анализ включались оригинальные исследования, обзорные статьи и клинические испытания, посвященные:

• –    классификации и механизмам действия адъювантов;

• –    структурно-функциональным характеристикам CpG-олигонуклеотидов (классы A, B, C, P);

• –    молекулярным механизмам TLR9-сигна-линга;

• –    химическим модификациям олигонуклеотидов (фосфоротиоатный остов, смешанный остов);

• –    системам доставки (конъюгация с лигандами, инкапсуляция в наночастицы);

• –    клиническому применению CpG-адъювантов в составе вакцин.

Исключались тезисы конференций, авторефераты диссертаций, нормативные документы и узкоспециализированные исследования, не содержащие обобщающих данных по заявленной теме.

Процесс отбора. Отбор публикаций проводился первым автором под пристальным контролем и при активном участии третьего автора. Первый и третий авторы вручную просматривали соответствующие списки найденных статей в поисках подходящих исследований. Все неясные моменты обсуждались со всеми авторами до достижения консенсуса. На первом этапе оценивались названия и аннотации, на втором – полные тексты отобранных статей. Соотношение включенных к просмотренным публикациям составило приблизительно 1 : 1,25. Для отбора статей использовали диаграмму PRISMA (рисунок).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эволюция адъювантов для вакцин

Анализ литературных данных позволяет проследить закономерную эволюцию адъювантных технологий – от простых систем, усиливающих иммунный ответ за счет неспецифического воспаления, до прецизионных инструментов, программирующих направленный иммунный ответ.

Первое поколение (эмпирическое) представлено солями алюминия, которым многие производители вакцин отдают предпочтение на протяжении почти века [1; 2]. Их механизм действия основан на создании депо антигена в месте инъекции, формировании гелевых микрочастиц, адсорбирующих антиген, и активации инфламмасомы NLRP3, что приводит к выработке провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-18 [2]. Главные преимущества этого класса – безопасность, подтвержденная многолетним опытом применения, а также надежная стимуляция гуморального иммунитета (T-хелперы 2 типа, Th2). Однако соли алюминия практически не активируют клеточное звено (Th1-ответ), что ограничивает их эффективность для защиты от внутриклеточных патогенов и для противораковых вакцин [2; 7].

Второе поколение (имитирующее) составили эмульсии, такие как MF59, AS03 и AF03 [2; 7]. В отличие от солей алюминия, они создают более мощный локальный сигнал опасности, активно привлекая иммунные клетки в место введения и индуцируя выработку хемокинов (CCL2, CCL4, CCL5, CXCL8) [2]. Эмульсии эффективно усиливают как гуморальный, так и, в некоторой степени, клеточный иммунный ответ, а также позволяют реализовать «антиген-сберегающую» стратегию, что особенно важно в условиях пандемий [4]. Однако их действие остается относительно широким и не всегда предсказуемым.

Третье поколение (доставляющее) представлено липосомами, виросомами и липидными наночастицами [1; 5; 6]. Эти системы делают шаг от неспецифической стимуляции к целенаправленной логистике: их ключевая задача – эффективная доставка антигена в антигенпрезентирующие

Р и с у н о к. Диаграмма PRISMA F i g u r e. The PRISMA flow chart

Источник: составлено авторами.

Source: compiled by the authors.

клетки и, в случае виросом, в цитозоль для запуска кросс-презентации и активации цитотоксических Т-лимфоцитов [2]. Липосомы стали основой революционных мРНК-вакцин против COVID-19, защищая нестабильную мРНК и обеспечивая ее доставку в клетки [5].

Четвертое поколение (программирующее) составляют TLR-агонисты, включая MPL (агонист TLR4) и CpG-олигонуклеотиды (агонисты TLR9) [7; 8; 9]. Эти молекулы представляют собой прецизионные инструменты, воздействующие на конкретные рецепторы врожденного иммунитета и отправляющие иммунной системе четкие сигналы для активации клеточной защиты (Th1) или усиления выработки антител (Th2) [7; 8; 10]. Это переход от неспецифического усиления к контролируемому программированию иммунного ответа.

Современной тенденцией является отход от монокомпонентных адъювантов в сторону комбинированных адъювантных систем, в которых реализуется синергия разных классов. Наиболее известные примеры таких систем:

• –    AS04 (MPL + гидроксид алюминия) – соль алюминия создает депо и усиливает гуморальный ответ, а MPL добавляет клеточный компонент через активацию TLR4 [7];

• –    AS01 (MPL + QS-21 + липосома) – липосома действует как система доставки, обеспечивая колокализацию антигена и иммуностимуляторов (MPL и сапонин QS-21) в антигенпрезентирующих клетках.

Выбор адъюванта представляет собой компромисс между эффективностью, безопасностью, сложностью синтеза и стоимостью, определяемый конкретной целью вакцинации. Будущее лежит в рациональном дизайне комбинированных систем, сочетающих сильные стороны разных классов для создания вакцин следующего поколения против наиболее сложных вызовов – ВИЧ, туберкулеза, онкологических заболеваний и новых пандемических угроз.

CpG-олигонуклеотиды: структура и классификация

CpG-олигонуклеотиды (CpG ODN) представляют собой синтетические олигодезоксинуклеотиды длиной 18–25 оснований, содержащие неметилированные цитозин-фосфат-гуаниновые (CpG) мотивы [11; 12]. Благодаря этому иммунная система позвоночных распознает CpG ODN как сигнал опасности, имитирующий вторжение патогенов [10; 11].

CpG ODN являются агонистами Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), который экспрессируется преимущественно в клетках врожденного иммунитета – В-лимфоцитах, плазмацитоидных дендритных клетках (pDC), макрофагах и моноцитах [11; 12]. Активация TLR9 запускает каскад сигнальных путей, ведущих к развитию как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа [10; 12].

Существует четыре основных класса CpG ODN, различающихся структурой, последовательностью и иммуностимулирующими свойствами [10]:

Класс А (D-тип) содержит один палиндром-ный CpG-мотив с фосфодиэфирной основой (PO), чувствительной к нуклеазам, и фосфо-ротиоатный (PS) поли(G)-хвост на 3'-конце для устойчивости к деградации. ODN класса А преимущественно активируют плазмацитоидные дендритные клетки, стимулируя выработку значительного количества интерферона-α (IFN-α), но не вызывают созревание pDC и не активируют В-клетки [10].

Класс В (K-тип) имеет полностью фосфоро-тиоатный остов и содержит множественные непалиндромные CpG-мотивы. ODN класса В сильно активируют В-клетки, стимулируя продукцию IL-6 и созревание pDC, однако индуцируют лишь минимальную выработку IFN-α [10]. К этому классу относится CpG 1018 – адъювант, одобренный для использования в вакцинах против гепатита В и COVID-19 [13; 14].

Класс С сочетает свойства классов А и В: содержит одну палиндромную последовательность CpG, активирует как В-клетки (подобно классу В), так и плазмацитоидные дендритные клетки с продукцией IFN-α (подобно классу А) [10].

Класс Р содержит две палиндромные последовательности CpG и демонстрирует иммуностимулирующие свойства, сходные с классом С [10].

Существуют также ODN со смешанной основой, в структуре которых комбинируются фосфодиэфирные и фосфоротиоатные связи, что обеспечивает баланс между стабильностью и естественностью структуры [10].

Роль фосфоротиоатных модификаций Для повышения устойчивости в организме природный фосфодиэфирный остов CpG ODN часто заменяют на фосфоротиоатный (PS), в котором один из немостиковых атомов кислорода в фосфатной группе заменен на серу. Такая модификация значительно повышает устойчивость олигонуклеотидов к нуклеазам, увеличивает время циркуляции в крови и, как следствие, усиливает иммуностимулирующую активность [9; 10]. Фос-форотиоатные модификации являются критически важными для терапевтического применения CpG ODN, поскольку немодифицированные аналоги быстро разрушаются в организме [10]. Как отмечается в обзоре [18], синтетические CpG ODN являются прочными, экономически эффективными и простыми в производстве, что делает их перспективными кандидатами для углубленных исследований врожденного иммунитета и механизмов иммунопротекции.

Молекулярный механизм действия

Механизм действия CpG ODN начинается с их распознавания Toll-подобным рецептором 9, локализованным в эндосомах иммунных клеток [11; 12]. После связывания лиганда запускается внутриклеточный сигнальный каскад с участием адаптерного белка MyD88, киназ IRAK, фактора TRAF6, MAP-киназ и транскрипционных факторов NF-κB, AP-1 и IRF-7 [12].

Активация этих факторов приводит к регуляции экспрессии генов цитокинов и хемоки-нов. В зависимости от типа активированных клеток и класса CpG ODN развиваются различные иммунные реакции [12]:

• –    плазмацитоидные дендритные клетки (pDC) под действием CpG ODN начинают продуцировать интерфероны I типа (IFN-α и IFN-β), а также провоспалительные цитокины IL-12 и TNF-α [10; 11];

• –    В-клетки активируются к пролиферации и выработке антител, а также секретируют IL-6 [10];

• –    естественные киллеры (NK-клетки), Т-клетки и макрофаги созревают, дифференцируются и пролиферируют под влиянием CpG ODN [11].

Важной особенностью CpG-индуцированного иммунного ответа является его направленность в сторону Th1-типа с выраженной продукцией интерферона-γ и активацией цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), что необходимо для формирования долговременного иммунитета против внутриклеточных патогенов [10].

Функциональные результаты активации TLR9 с помощью CpG ODN очень зависят от контекста и таких факторов, как класс ODN, тип клетки-мишени и тип тканей, в котором развивается патологический процесс [12]. В некоторых случаях, например при повреждении печени, вызванном парацетамолом, CpG ODN (ODN 1826) демонстрирует защитное действие через активацию метаболического пути TLR9/IRG1/ итаконат в макрофагах, что подавляет апоптоз этих клеток и снижает выработку провоспали-тельных цитокинов TNF-α, IL-6 и CCL2 [12].

Видоспецифичность TLR9

TLR9 человека и мыши различаются по аминокислотной последовательности (гомология составляет лишь 76 %), что объясняет существование разных оптимальных CpG-мотивов. Мышиные мотивы GACGTT и AACGTT слабо активны в клетках человека; напротив, мотив GTCGTT (использованный в CpG 7909) эффективно активирует TLR9 человека [13]. Кроме того, у человека TLR9 не экспрессируется в макрофагах и конвенциональных дендритных клетках, в отличие от мышей, где эти клетки также реагируют на CpG. Это различие может объяснять более благоприятный профиль безопасности CpG в клинических исследованиях по сравнению с мышиными моделями, где высокая доза CpG способна вызывать избыточную продукцию TNF-α макрофагами [13].

Клиническое применение CpG-адъювантов

CpG ODN нашли широкое применение в качестве адъювантов для вакцин, иммунотерапевтических средств и иммунопротекторов [10; 12]. Наиболее успешным примером является CpG 1018 - адъювант класса В, специфически активирующий TLR9 и индуцирующий сильные клеточные реакции Th1-типа. Он был одобрен для использования в вакцине против гепатита B (HEPLISAV-B®), где продемонстрировал более быстрое развитие и более высокие титры защитных антител по сравнению с традиционными адъювантами, особенно в группах пациентов с ослабленным иммунным ответом [13; 14]. CpG 1018 используется в дозе 3 мг на одну дозу вакцины [13].

В ходе пандемии COVID-19 CpG 1018 был применен в вакцине SCB-2019 , получившей одобрение для экстренного применения. Клинические исследования фазы 1 и 2/3 подтвердили ее иммуногенность и безопасность [15; 19]. Другие вакцины на основе CpG, такие как SpikoGen (Advax-CpG55.2) и вакцина компании Biological E (Alum-CpG), были разработаны и одобрены в ряде стран [7].

Другие CpG ODN также демонстрируют клинический потенциал. CpG 7909 (на основе мотива GTCGTT) использовался в вакцинах против малярии. Клинические испытания I фазы показали возможность снижения дозировки антигена, а эффективная доза составила 0,125–1 мг [10; 13]. Адъювант IC31 на основе CpG ODN прошел обширную доклиническую и клиническую оценку в составе различных субъединичных вакцин [10].

В ветеринарии CpG ODN также демонстрируют иммуностимулирующее действие. У птиц, обладающих специфичным TLR21, распознающим CpG-мотивы, эти олигонуклеотиды усиливают защиту против Escherichia coli , Salmonella Typhimurium и Campylobacter spp. за счет активации цитотоксических Т-клеток и выработки цитокинов [10].

Исследования на мышиных моделях показывают эффективность CpG-адъювантных вакцин против вируса Кьясанурского леса (KFD); концентрации 2–10 мкг CpG на дозу продемонстрировали безопасность и отсутствие побочных эффектов [11]. Вакцинация с CpG индуцировала повышенную выработку провоспалительных цитокинов IL-12, TNF-α, усиливала противовирусный ответ за счет увеличения продукции IFN-γ и обеспечивала более эффективный гуморальный иммунитет [11].

Клинические исследования показывают, что CpG-адъюванты могут вызывать местные реакции (боль, отек, эритему) и системные гриппоподобные симптомы, которые обычно имеют легкую или умеренную степень и проходят самостоятельно в течение нескольких дней [13]. Разработка более активных мотивов, таких как GTCGTT для CpG 7909, позволила снизить эффективную дозу, что потенциально улучшает соотношение пользы и риска [13].

Проблемы доставки и стратегии их решения

Несмотря на впечатляющие успехи, CpG ODN сталкиваются с рядом ограничений, характерных для всех терапевтических олигонуклеотидов.

Нестабильность in vivo. Немодифициро-ванные CpG ODN быстро разрушаются нуклеазами сыворотки крови, что требует химических модификаций. Замена фосфодиэфирных связей на фосфоротиоатные (PS) значительно повышает устойчивость к деградации и увеличивает время циркуляции в организме [10].

Проблемы доставки. CpG ODN представляют собой крупные (7–8 кДа) полианионные молекулы, которым трудно проникать через клеточные мембраны. Их мишень (TLR9) локализована внутри эндосом, что требует эффективного эндоцитоза и последующего высвобождения из эндосомального компартмента. Для преодоления этих барьеров разрабатываются различные подходы:

• 1.    Конъюгация с лигандами, обеспечивающими направленный транспорт. Наиболее успешным примером является конъюгация с N-ацетилгалактозамином (GalNAc) для доставки в гепатоциты, что позволяет эффективно накапливать CpG в печени [17].

• 2.    Инкапсуляция в наночастицы. Использование липосом, PLGA-наночастиц и липидных наночастиц не только защищает CpG от нуклеаз, но и обеспечивает колокализацию адъюванта с антигеном в антигенпрезентирующих клетках, что критически важно для эффективной иммуностимуляции [17].

• 3.    Комплексирование с поликатионными пептидами. Перспективным направлением является создание комплексов CpG ODN с гла-тирамера ацетатом (GA) в поликатионные наночастицы. Такой подход позволяет локализовать и постепенно высвобождать CpG в области поражения в течение 96 ч, тогда как «свободный» CpG быстро диффундирует из места инъекции. Комплексирование сохраняет противоопухолевую эффективность и значительно снижает системный выброс провоспалительных цитокинов, таких как IL-6 [17].

• 4.    Растворимые микроиглы. Разработка нановакцин на основе CpG и опухолевой РНК, доставляемых с помощью растворимых микроигл, демонстрирует способность индуцировать длительный противоопухолевый иммунитет и иммунную память, а также позволяет стабилизировать

• 5.    Металлические наночастицы. Золотые наностержни в комбинации с CpG усиливают иммунную активацию и компенсируют иммуносупрессивные эффекты, связанные с фото-термальной терапией опухолей [21].

• 6.    Гибридные наноплатформы. CpG, инкапсулированный в мезопористые кремниевые наночастицы с оболочкой из бактериальных мембранных везикул (OMV), обеспечивает точное нацеливание на опухоль, перепрограммирование микроокружения и активацию Т-клеточного иммунитета с минимальной системной токсичностью [22].

CpG и сохранять его активность до 30 дней при комнатной температуре [20].

Комбинированные адъювантные системы. Включение CpG ODN в состав муль-тикомпонентных адъювантных систем позволяет достичь синергического эффекта. Например, сочетание CpG с MPLA (агонист TLR4) в липосомальных носителях обеспечивает одновременную активацию TLR9 и TLR4, что усиливает врожденный иммунный ответ [7]. В комбинации с ингибиторами контрольных точек (анти-PD-1) такие системы продемонстрировали усиление рекрутинга цитотоксических CD8+ Т-клеток и NK-клеток в микроокружение опухоли, открывая новые перспективы для иммунотерапии солидных опухолей [17].

Потенциальная реактогенность. Сильная активация врожденного иммунитета может приводить к системным побочным эффектам, таким как лихорадка и гриппоподобный синдром, особенно при высоких дозах. Однако разработка более активных мотивов позволила снизить эффективную дозу (например, до 0,125–1 мг для CpG 7909), что улучшает соотношение польза / риск [13]. Локальное введение комплексированных форм CpG также снижает системные побочные эффекты [17].

Зависимость эффекта от контекста. Иммуностимулирующее действие CpG ODN сильно варьирует в зависимости от класса ODN, типа клеток-мишеней и микроокружения. В некоторых случаях, как показано в исследовании на модели повреждения печени [12], CpG ODN могут не активировать, а подавлять воспалительный ответ, что требует осторожности при терапевтическом применении.

Сравнение CpG с другими терапевтическими олигонуклеотидами

Сравнительная характеристика основных классов терапевтических олигонуклеотидов представлена в таблице. Принципиальное отличие заключается в том, что CpG ODN являются иммуностимуляторами, тогда как ASO, siRNA и аптамеры предназначены для подавления или модуляции функции конкретных генов или белков [6; 23; 24].

ASO и siRNA нацелены на специфические мРНК и либо разрушают их (через РНКазу H или RISC), либо блокируют трансляцию [6; 24; 25]. Их задача – частично или полностью подавить экспрессию определенного гена, например, при наследственных заболеваниях или онкологической патологии. CpG, напротив, не подавляет, а активирует иммунную систему, запуская каскад реакций, защищающих организм от патогенов [24; 10].

Аптамеры представляют собой трехмерные структуры, связывающиеся с белками-мишенями подобно антителам и модулирующие их функцию [6; 25]. Они действуют на уровне белков, блокируя, например, факторы роста или воспалительные цитокины. CpG также взаимодействует с белком TLR9, но результатом этого взаимодействия становится не подавление, а запуск сигнального каскада, ведущего к активации множества иммунных клеток и продукции широкого спектра цитокинов [11; 12].

Таким образом, если ASO, siRNA и аптамеры являются инструментами «точечного вмешательства» в конкретные молекулярные события, то CpG системно активизирует и мобилизует собственные защитные силы организма.

Перспективы развития

Дальнейшее развитие области CpG-адъювантов связано с несколькими взаимосвязанными направлениями, которые можно разделить на химические, технологические и клинические.

Оптимизация химической структуры. Разработка новых классов и модификаций CpG ODN остается активной областью исследований. Помимо классических фосфоротио-атных модификаций, изучаются комбинации с 2'-O-метил- и 2'-фторзамещениями, позволяющие дополнительно повысить устойчивость к нуклеазам и снизить неспецифическую иммуностимуляцию [9; 14]. Перспективным направлением является создание функциональных аптамеров на основе CpG-мотивов, которые сочетают высокоаффинное связывание с TLR9 и способность модулировать активность других молекул-мишеней [29].

Т а б л и ц а. Сравнительная характеристика основных классов терапевтических олигонуклеотидов

T a b l e. Comparative characteristics of the main classes of therapeutic oligonucleotids

Характеристика / Characteristic	ASO	siRNA	Аптамеры / Aptamers	CpG ODN
Мишень / Target	мРНК / mRNA	мРНК / mRNA	Белки / Proteins	TLR9
Механизм /	Деградация	Деградация	Высокоаффинное связывание,	Активация сигнального
Mechanism	через РНКазу H или стерическое блокирование / Degradation via RNase H or steric blocking	через RISC / Degradation via RISC	блокирование функции / High-affinity binding, function blocking	каскада / Activation of signaling cascade
Результат /	Подавление экспрессии гена /		Ингибирование функции белка /	Активация врожденного
Outcome Тип ответа / Response type	Gene expression suppression Ингибирующий / Inhibitory		Protein function inhibition Ингибирующий / модулирующий / Inhibitory/modulatory	и адаптивного иммунитета / Activation of innate and adaptive immunity Иммуностимулирующий (Th1) / Immunostimulatory (Th1)

Примечание: ASO – антисмысловые олигонуклеотиды; RISC – РНК-индуцированный сайленсинг-комплекс; TLR9 – Toll-подобный рецептор 9; Th1 – T-хелперы 1 типа.

Note: ASO – antisense oligonucleotides; RISC – RNA-induced silencing complex; TLR9 – Toll-like receptor 9; Th1 – T-helper type 1.

Источник: ASO – [6; 8]; siRNA – [6; 8; 23]; аптамеры – [26; 27; 28]; CpG – [9; 13; 14; 16; 17; 18].

Source: ASO – [6; 8]; siRNA – [6; 8; 23]; aptamers – [26; 27; 28]; CpG – [9; 13; 14; 16; 17; 18].

Синтетические CpG ODN являются прочными, экономически эффективными и простыми в производстве, что делает их перспективными кандидатами для углубленных исследований врожденного иммунитета и механизмов иммунопротекции [18].

Примечательно, что олигонуклеотиды с определенными модифицированными последовательностями могут выступать не активаторами, а ингибиторами TLR9. В обзоре, посвященном ингибиторным олигонуклеотидам, предлагается классификация таких соединений на классы G, R и B в зависимости от их клеточных и молекулярных мишеней [30]. Эти соединения подавляют избыточную активацию TLR9, что открывает перспективы для лечения аутоиммунных заболеваний (системная красная волчанка, псориаз) и воспалительных состояний, связанных с гиперреактивностью этого рецептора [30]. В клинических испытаниях находятся антагонисты TLR9, такие как IMO-8400 и IMO-3100, которые проходят оценку при псориазе, дерматомиозите и других воспалительных заболеваниях1.

Комбинированные адъювантные системы. Создание мультикомпонентных систем, сочетающих CpG с другими иммуностимуляторами (MPLA, QS-21) в липосомальных носителях, позволяет достичь синергической активации врожденного иммунитета и формировать сбалансированный ответ, необходимый для защиты от сложных патогенов [7; 17]. В доклинических исследованиях показано, что комбинация CpG с агонистами STING или RIG-I обеспечивает более мощную активацию дендритных клеток и усиление противоопухолевого иммунитета по сравнению с монотерапией CpG [17].

Применение в онкоиммунологии. CpG ODN способны «перепрограммировать» иммунное микроокружение, трансформируя опухоль-ас-социированные макрофаги из проопухолевого M2-фенотипа в противоопухолевый M1-фено-тип. В комбинации с ингибиторами контрольных точек (анти-PD-1, анти-PD-L1) такая стратегия усиливает рекрутинг цитотоксических CD8+ Т-клеток и NK-клеток в микроокружение опухоли, что показано на моделях меланомы, рака яичников и колоректального рака [17; 23]. Разработка нановакцин на основе CpG и опухолевой РНК, доставляемых с помощью растворимых микроигл, демонстрирует способность индуцировать длительный противоопухолевый иммунитет и иммунную память [20]. Современные подходы также включают создание гибридных наноплатформ, таких как CpG, инкапсулированный в мезопористые кремниевые наночастицы с оболочкой из бактериальных мембранных везикул, что обеспечивает точное нацеливание на опухоль, перепрограммирование микроокружения и активацию Т-клеточного иммунитета с минимальной системной токсичностью [22].

Разработка систем доставки нового поколения. Локальное высвобождение CpG с помощью наночастиц и поликатионных комплексов позволяет снизить системную токсичность и повысить эффективность, особенно в терапии солидных опухолей и локальных инфекций. Перспективными платформами являются:

- липидные наночастицы (LNP) , зарекомендовавшие себя в мРНК-вакцинах; их модификация для совместной доставки CpG и антигена обеспечивает колокализацию адъюванта и иммуногена в одних и тех же антигенпрезентирующих клетках [5; 17];

– полимерные наночастицы на основе PLGA , позволяющие контролировать скорость высвобождения CpG в течение нескольких недель [17];

– комплексы с глатирамера ацетатом , обеспечивающие длительное (до 96 ч) локальное высвобождение CpG и значительное снижение системных побочных эффектов [17];

– металлические наночастицы (золотые наностержни) в комбинации с CpG усиливают иммунную активацию и компенсируют иммуносупрессивные эффекты, связанные с фото-термальной терапией опухолей [21];

• -    растворимые микроиглы , позволяющие стабилизировать CpG и доставлять его с антигеном, сохраняя активность до 30 дней при комнатной температуре [20];

• -    гибридные наноплатформы с оболочкой из бактериальных мембранных везикул, обеспечивающие нацеливание на опухоль и перепрограммирование иммунного микроокружения [22].

Безопасность и клиническое применение. Анализ безопасности CpG-адъювантов, проведенный на данных клинических испытаний вакцин HEPLISAV-B и COVID-19 на основе CpG 1018, а также исследования нелитимода (SD-101) в комбинации с ингибиторами контрольных точек, показал отсутствие повышенного риска иммуно-опосредованных нежелательных явлений. Частота таких событий для HEPLISAV-B составила 0,32 % (сравнимая с алюминиевыми адъювантами), для CpG 1018 в COVID-19 вакцинах – 0–2,1 %, а добавление нелитимо-да к пембролизумабу не увеличило частоту иммуноопосредованных событий по сравнению с монотерапией [31].

Снижение стоимости и масштабирование производства. Совершенствование методов синтеза и очистки CpG ODN, включая разработку более эффективных протоколов фосфорамидитного синтеза и внедрение автоматизированных платформ для крупномасштабного производства, позволит снизить стоимость этих адъювантов. Это особенно важно для их применения в вакцинах массового спроса (грипп, гепатит, ВПЧ) и для стран с низким и средним уровнем дохода [13; 14].

Новые области применения. Помимо традиционных вакцин против инфекционных заболеваний, CpG-адъюванты активно исследуются в контексте:

• –    аллерген-специфической иммунотерапии – CpG ODN смещают аллергический Th2-ответ в сторону Th1, снижая продукцию IgE и уменьшая клинические проявления аллергии [7];

• –    вакцин против гельминтозов – CpG усиливает защитный ответ против паразитарных инфекций, где требуется активация Th1-и Th17-звеньев [10];

  – иммунотерапии хронических вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит В) – CpG применяется для «пробуждения» латентных вирусных резервуаров в комбинации с антиретровирусными препаратами [12].

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный анализ демонстрирует закономерную эволюцию адъювантных технологий от эмпирического усиления иммунного ответа (соли алюминия) через имитацию инфекции (эмульсии) и целенаправленную доставку (липосомы, наночастицы) к программированию иммунного ответа с помощью TLR-агонистов, таких как CpG-олигонуклеотиды. Эта эволюция отражает переход от неспецифической стимуляции к контролируемому и предсказуемому управлению иммунными реакциями, что особенно важно для разработки вакцин против внутриклеточных патогенов и для противораковой иммунотерапии.

CpG ODN занимают уникальное место среди терапевтических олигонуклеотидов, выступая не в роли ингибиторов экспрессии генов (как ASO, siRNA), а в роли мощных активаторов врожденного и адаптивного иммунитета [6; 23]. Их способность индуцировать сбалансированный гуморальный и клеточный (Th1) ответ, активировать цитотоксические Т-лимфоциты и плазмацитоидные дендритные клетки делает их незаменимыми для создания вакцин нового поколения.

Ключевым достижением последних лет стала демонстрация клинической эффективности CpG-адъювантов. Одобрение CpG 1018 в составе вакцин HEPLISAV-B (против гепатита В) и SCB-2019 (против COVID-19) подтверждает безопасность и эффективность этого класса адъювантов для человека [13; 14; 19]. Особенно важным является то, что CpG 1018 показал высокую эффективность в группах пациентов с ослабленным иммунным ответом, где традиционные адъюванты недостаточно эффективны [13].

Несмотря на успехи, остаются нерешенными проблемы, связанные с доставкой CpG ODN к клеткам-мишеням. Разработка систем доставки, обеспечивающих локальное высвобождение CpG и снижение системной токсичности, открывает новые перспективы для терапии солидных опухолей [17; 20; 21]. Анализ безопасности современных CpG-адъювантов подтверждает их благоприятный профиль, сравнимый с традиционными адъювантами [31].

Дальнейшее развитие CpG-адъювантов связано с оптимизацией химической структуры, созданием систем направленной доставки и включением в мультикомпонентные адъювантные системы, а также с расширением терапевтического спектра – от вакцин до онкоиммунологии и лечения аутоиммунных заболеваний [7; 17; 30].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

CpG-олигонуклеотиды представляют собой один из наиболее перспективных классов адъювантов для вакцин нового поколения. Их уникальность заключается в способности избирательно активировать TLR9, запуская каскад сигнальных путей, ведущих к формированию сбалансированного Th1-иммунного ответа, необходимого для защиты от внутриклеточных патогенов и для противораковой иммунотерапии.

Разнообразие классов CpG ODN (A, B, C, P) позволяет тонко настраивать иммунный ответ в зависимости от поставленной задачи, а возможность химической модификации (фосфоротиоатный остов, смешанный остов) обеспечивает необходимую стабильность in vivo .

Клинический успех CpG 1018 в составе вакцин HEPLISAV-B и SCB-2019 подтверждает безопасность и эффективность этого класса адъювантов для человека, открывая путь к их более широкому применению [13; 15; 19].

Наиболее перспективными направлениями дальнейших исследований являются:

• 1.    Оптимизация химической структуры CpG ODN для улучшения фармакокинетических свойств и снижения реактогенности.

• 2.    Разработка систем направленной доставки, включая наноразмерные носители (липосомы, PLGA-наночастицы, металлические наночастицы, растворимые микроиглы) и конъюгаты с лигандами.

• 3.    Включение CpG-олигонуклеотидов в состав мультикомпонентных адъювантных систем для достижения синергического эффекта.

• 4.    Применение CpG в онкоиммунологии для перепрограммирования опухоль-ассо-циированных макрофагов и преодоления резистентности к ингибиторам контрольных точек.

• 5.    Разработка ингибиторных CpG для лечения аутоиммунных заболеваний, связанных с гиперреактивностью TLR9.

Дальнейшие исследования в этой области открывают путь к созданию вакцин нового поколения против социально значимых инфекций и онкологических заболеваний, а также к разработке новых терапевтических подходов для лечения аутоиммунных патологий [7; 17; 30].