Определение химического состава мочевого камня in vivo по профилю потребления нутриентов

Стандартное спермиологическое исследование, выполняемое согласно руководству ВОЗ, остается на сегодняшний день основным методом оценки мужской фертильности [1]. Вместе с тем, данный метод исследования имеет ряд существенных ограничений,в том числе низкую прогностическую ценность в отношении результатов программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и исходов беременности, достигнутой естественным путем [2].

Ограничения стандартного спермиологического исследования диктуют необходимость использования дополнительных методов оценки мужской фертильности. В качестве наиболее перспективного и широко используемого теста выступает оценка уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. Результаты недавних исследований демонстрируют связь уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с нарушением развития эмбрионов в программах ВРТ, вероятностью наступления беременности в программах ВРТ и при естественном зачатии,а также с невынашиванием беременности [2-8].

Вопрос широкого внедрения исследования фрагментации ДНК сперматозоидов в клиническую практику и определение показаний к данному исследованию по-прежнему обсуждается. Важным фактором, ограничивающим его использование, является отсутствие стандартизации существующих методов оценки фрагментации ДНК [9]. Дополнительным фактором, ограничивающим широкое внедрение исследования фрагментации ДНК сперматозоидов (ФДС) в диагностику мужского бесплодия, является стоимость. По сравнению с другими тестами на фертильность мужчин, тест на фрагментацию ДНК является дорогостоящим, при этом расходы, как правило, ложатся на пациента. В связи с этим активно изучается корреляция между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов и стандартными параметрами спермы, что потенциально может позволить отбирать пациентов, которым выполнять исследование фрагментации ДНК сперматозоидов нецелесообразно.

Целью настоящего исследования явилось изучение связи уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с по- казателями стандартного спермиологического исследо вания и возрастом мужчин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужили результаты обследования 121 мужчины в возрасте от 21 года до 53 лет (средний возраст 32,7±4,5 года), прошедших обследование в клинике «Мать и Дитя Ярославль» в период с января 2019 по апрель 2020 года. Исследование носило ретроспективный характер, в связи с чем, фертильный статус мужчин не уточнялся. Критериями исключения для настоящего исследования были тяжелые формы олигозооспермии (концентрация сперматозоидов менее 1 млн/мл) и азооспермия.

Спермиологическое исследование

Образцы спермы были собраны в специально отведенном для этого помещении нашей лаборатории с помощью аудиовизуальной стимуляции после 2-5 дней сексуального воздержания. Стандартное спермиологи-ческое исследование выполнялось согласно последнему изданию Руководства ВОЗ [1].

Исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов

Повреждение ДНК сперматозоидов оценивали с помощью анализа TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) на основе проточной цитометрии и сообщали % фрагментации ДНК сперматозоидов, отражая процент сперматозоидов с поврежденной ДНК.

Статистическая обработка

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS 11.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). С целью выявления взаимосвязи уровня фрагментации ДНК сперматозоидов и стандартных параметров спермы, а также возраста мужчин, был применен метод корреляционного анализа с расчетом коэффициента параметрической корреляции Пирсона. Критерием статистической значимости корреляции считали p<0,05. Для интерпретации зависимости силы между параметрами исследования предполагались следующие уровни корреляции: <0,2 – отсутствие связи, 0,2– 0,4 – слабая связь, 0,4–0,7 – умеренная связь, > 0,7сильная связь. Критерий Манна-Уитни использовали для оценки значимости различий непараметрических непрерывных переменных, таких как параметры спермы. Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у 121 мужчины продемонстрировало значения в интервале от 1% до 45,7%, средний показатель 11,4± 7,8%. У 30 пациентов уровень фрагментации ДНК был более 15% (среднее значение 22,0±7,2%), а у 91 пациента уровень фрагментации ДНК был менее 15% (среднее значение 7,9±3,9%). В таблице 1 представлены средние значения параметров стандартного спермиологического исследования в общей выборке и в подгруппах с уровнем ФДС <15% и ФДС ≥15%.

Сравнительный анализ групп пациентов с ФДС <15% (n =91) и ФДС ≥15% (n = 30) не выявил достоверных различий по таким параметрам как возраст пациента, объем эякулята, концентрация сперматозоидов, общая подвижность, доля морфологически нормальных форм, процент аномалий головки в структуре морфо логических дефектов и концентрация лейкоцитов спермы. Достоверные отличия между группами наблю дались только по параметру прогрессивной подвижности и общей подвижности. Среднее значение доли прогрессивно подвижных форм сперматозоидов было значимо выше в группе пациентов ФДС <15% (55,07±18,1%) по сравнению с группой пациентов с ФДС ≥15% (46,2±19,8%).

Результаты корреляционного анализа (табл. 2) вы явили слабую отрицательную связь между уровнем ФДС и долей прогрессивно-подвижных форм – r = -0,26 ( p <0,01). Корреляция ФДС с другими параметрами спермы (объем, концентрация, общая подвижность, нормальная морфология, дефекты головки, концентра ция лейкоцитов) и возрастом пациентов признана очень слабой и статистически незначимой.

Дополнительно выполнено парное сравнение ча стоты встречаемости повышенной ФДС (>15%) в груп пах нормальный объем спермы/олигоспермия, нормальная концентрация сперматозоидов/олигозооспер мия, нормальная морфология/тератозооспермия, нор

Таблица 1. Результаты стандартного спермиологического исследования Table 1. Results of a standard sperm examination

Параметр Parameter	Общее среднее значение ± SD General mean ± SD	ФДС <15%(n =91) FDS <15% (n = 91)	ФДС ≥15% (n = 30) FDS ≥15% (n = 30)	p
Возраст, лет Age, year	34,3±5,54	34,5±5,7	33,7±4,8	0,45
Объем эякулята, мл Volume, ml	3,82±2,00	3,9±2,11	3,5±1,6	0,44
Концентрация, млн/мл Concentration, mln/ml	46,00±29,5	48,5±29,7	38,2±27,9	0,10
Прогрессивная подвижность, % Progressive mobility, %	52,8±18,8	55,07±18,1	46,2±19,8	0,03
Общая подвижность, % Total mobility, %	60,9±16,5	62,8±16,0	55,06±16,9	0,02
Нормальная морфология, % Normal morphology, %	2,0±1,3	2,1±1,2	1,8±1,3	0,30
Доля аномалий головки, % Proportion of head anomalies, %	68,4±9,1	69,2±8,8	65,9±9,6	0,08
Лейкоциты, млн/мл Leukocytes, mln/ml	0,125±0,05	0,18±0,15	0,22±0,23	0,22

Таблица 2.Корреляции Пирсона уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с возрастом и параметрами стандартного спермиологического исследования

Table 2. Pearson correlations of the level of sperm DNA fragmentation with age and parameters of standard sperm examination

Параметр Parameter Коэффициент корреляции Correlation coefficient p Возраст, лет Age, year -0,021 0,820 Объем эякулята, мл Volume, ml 0,010 0,915 Концентрация Concentration -0,171 0,061 Количество Number -0,140 0,126 Прогрессивно-подвижных Progressively mobile -0,262 0,004 Общая подвижность General mobility -0,053 0,591 Непрогрессивно-подвижных Non-progressive-mobile 0,178 0,050 Неподвижных Non-progressive-mobile 0,130 0,156 Морфология Мorphology -0,157 0,086 Дефекты головки Head defects -0,053 0,560 Лейкоциты Leukocytes -0,192 0,013 мальная прогрессивная подвижность сперматозоидов /астенозооспермия (табл. 3).

Результаты анализа продемонстрировали, что повышенная ФДС в 1,8 раз чаще встречается среди пациентов с астенозооспермией (21,4%) по сравнению с пациентами с нормальной подвижностью сперматозоидов (11,8%) ( p <0,05). Сравнительный анализ в группах нормальная морфология сперматозоидов/тератозооспермия и нормальное количество сперматозоидов/олигозооспермия нормальный объем спермы/олигоспермия не выявил достоверных различий.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенного нами ретроспективного исследования продемонстрировали связь между про грессивной подвижностью и уровнем ФДС при отсут ствии взаимосвязи между уровнем ФДС и возрастом, а также другими параметрами спермы (морфология общее количество сперматозоидов). Выявленная кор реляция между долей прогрессивно-подвижных форм и уровнем ФДС характеризуется как слабая (r = -0,26) при этом повышенный уровень ФДС (≥15%) в 1,8 раза чаще встречается среди пациентов с астенозооспер мией по сравнению с пациентами с нормальной по движностью сперматозоидов.

Причина взаимосвязи уровня ФДС и прогрессив ной подвижности сперматозоидов не совсем ясна. Ве роятно, это связано с тем, что упаковка хроматина (за мена гистонов на протамины в ядре сперматозоида) и развитие жгутика сперматозоида происходят на одном и том же этапе сперматогенеза – спермиогенезе [10]. Экспериментальные исследования на животных моде лях, в которых процесс упаковки хроматина искус ственно нарушался за счет снижения экспрессии протамина или переходных белков, продемонстриро вали связь нарушенной упаковки хроматина с уровнем аномалий жгутика и низкой подвижностью спермато зоидов [11, 12]. Так же предполагается роль оксидатив ного стресса, так как избыток активных форм кислорода может приводить к перекисному окислению липидов мембраны сперматозоидов и нарушению подвижности, а транслокация перекисей липидов в ядро может при вести к повреждению ДНК сперматозоида [13, 14].

На сегодняшний день, связь между уровнем ФДС и параметрами стандартного спермиологического ис следования остается противоречивой. В таблице 4 представлены результаты исследований, изучающих связь ФДС с результатами стандартного спермиологи ческого исследования.

Ни одно из представленных исследований не вы явило взаимосвязи между объемом эякулята и уровнем ФДС. Слабая отрицательная корреляция между кон центрацией сперматозоидов и уровнем ФДС выявлена в двух из 11 представленных исследований [15, 16]. Значи мая отрицательная корреляция доли прогрессивно

Таблица 3. Частота встречаемости нормальной и повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов в подгруппах нормальное значение параметров спермы/отклонение от нормы

Table 3. Frequency of occurrence of normal and increased sperm DNA fragmentation in subgroups of normal sperm parameter / deviation from the norm

Параметр Parameter Фрагментация ДНК сперматозоидов Sperm DNA fragmentation Асимптотическая значимость (2-сторонняя) Asymptotic significance (2-sided) ФДС <15% FDS <15% ФДС≥15% FDS ≥15% Объем эякулята Нормальный объем, % (n) Normal volume, % (n) 95,7% (89) 100,0% (28) 0,641 Volume Олигоспермия, % (n) Oligospermia, % (n) 4,3% (4) 0,0% (0) Концентрация Нормальная концентрация, % (n) Normal concentration, % (n) 87,1% (81) 82,1% (23) 0,157 Concentration Олигоспермия, % (n) Oligospermia, % (n) 12,9% (12) 17,9% (5) Прогрессивная подвижность Progressive mobility Нормальная прогрессивная подвижность, % (n) Normal progressive mobility, % (n) 88,2% (82) 78,6% (22) 0,036 Астенозооспермия, % (n) Asthenozoospermia, % (n) 11,8% (11) 21,4% (6) Морфология Нормальная морфология, % (n) Normal morphology, % (n) 13,2% (12) 10,0% (3) 0,296 Morphology Тератозооспермия, % (n) Teratozoospermia, % (n) 86,8% (79) 90,0% (27) подвижных сперматозоидов с уровнем ФДС отмечена в 6 исследованиях, при этом уровень связи варьировал от слабой до умеренной [17-20, 21]. Умеренная отрица тельная связь доли морфологически нормальных форм и уровня ФДС наблюдалась в 4 исследованиях, в одном исследовании имела место слабая отрицательная кор реляция, а в 5 исследованиях связи между морфологией сперматозоидов и уровнем ФДС не выявлено [10, 15, 20, 22-24]. В одном из представленных исследований про демонстрирована слабая положительная корреляция уровня ФДС с долей аномалий головки в структуре морфологических дефектов [22], в то время как резуль таты проведенного нами исследования не выявили связи между этими параметрами.

Особого внимания заслуживает исследование P.J. Stahl и соавт., где одни и те же пробы спермы иссле довались с использованием сразу двух методов оценки ФДС: SCSA (Sperm chromatin structure assay) и TUNEL [16]. Изучение корреляция уровня ФДС и стандартных параметров спермы показало разные результаты для каждого из методов. Результаты SCSA демонстриро вали достоверную умеренную корреляцию с концент рацией сперматозоидов и общей подвижностью спер матозоидов, в то время как результаты TUNEL корре лировали только с общей подвижностью сперматозои дов, и корреляция была очень слабой (табл. 4). Резуль таты данного исследования ставят под сомнение возможность сравнения результатов исследований, использующих разные методы оценки уровня ФДС.

В определенной степени использование различ ных методов оценки ФДС могло бы объяснить проти воречивые данные исследований, оценивающих корреляцию уровня ФДС и параметров стандартного спермиологического исследования. Прямые (TUNEL) и непрямые (SCD (Sperm Chromatin Dispersion), SCSA) методы оценки ФДС имеют концептуальное различие. Непрямые методы, являются мерой «потенциального» повреждения ДНК сперматозоидов, в отличие от пря мых методов,выявляющих «реальное» повреждение ДНК сперматозоидов [25]. Сопоставление результатов

Таблица 4. Результаты исследований, изучавших связь фрагментации ДНК сперматозоидов с результатами стандартного спермиологического исследования

Table 4. Results of studies investigating the relationship of sperm DNA fragmentation with the results of standard sperm examination

		Метод оценки ФДС FDS estimation method	Подгруппы Subgroups	Д ни воздержания Days of abstinence	Объем Volume	Концентрация Concentration	Прогрессивно-подвижные формы Progressively mobile forms	Общая подвижность General mobility	Жизнеспособность Viability	Морфология Morphology	Аномалии головки Anomalies of the head penis
Keshteli S.H., 16 [10]	7	SCD				-0,05 NS		-0,15 NS		-0,60**
Belloc. S., 2014 [17]	13	TUNEL	aстенозооспермия			-0,002 NS	0,18**			-0,13 NS
	53		Оолигозооспермия			0,14 NS	-0,08 NS			-0,1 NS
	18		тератозооспермия			-0,13 NS	-0,26**			-0,12 NS
Evgeni E., 2015 [18]	69	CD	пормоспермия		0,374 NS	-0,036 NS	-0,175 NS			-0,211 NS
			патоспермия		-0,017 NS	-0,189 NS	-0,536**			-0,180 NS
Le M.T., 2019 [22]	18	CD			-0,022 NS	-0,080 NS	-0,168 *		-0,85 NS	0,55 ‘ D	0,202 **
Brahem S.,2012 [23]	0	UNEL						0,646**	0,878** 0	0,434** D
Samplaski M.K., 2015[31]	049	CD							-0,83**
Al Omrani B., 2018 [19]	4	CD	ФДС <15%		-0,06 NS	-0,02 NS	-0,36*			-0,096 NS
			ФДС 15–30%		00,209 NS	-0,133 NS	-0,334 NS			-0,018 NS
			ФДС> 30%		00,18 NS	-0,009 NS	-0,334 NS			0,198 NS
Gill K., 2019 [15]	67	CD			-0,010 NS	-0,289**	-0,524**		-0,524**	-0,457**
Stahl P.J., 2015 [16]	12	CSA			-0,06 NS	-0,34**		-0,45**		-0,1 NS
		UNEL			-0,1 NS	-0,01 NS		-0,15*		0,06 NS
Yuan M., 2019 [20]	39	CSA		0,332*		0,157 NS	-0,266*		-0,194*	-0,248*	-0,191*
Homa S.T., 2019 [21]	96	CSA			-0,486**	0,539**	-0,572**	-0,19*

Примечание. Достоверность выявленной корреляции: NS - статистически недостоверна, * p <0,05, ** p <0,001; о — корреляция c % нежизнеспособных форм; □ - корреляция с долей морфологически аномальных форм

Note. Significance of the revealed correlation: NS - statistically insignificant, * p <0,05, ** p <0,001; о - correlation with% of non-viable forms; □ - correlation with the proportion of morphologically abnormal forms методов противоречивы.В рассмотренном ранее исследовании P.J. Stahl и соавт. результаты SCSA слабо коррелировали с результатами TUNEL (г= 0,31, p <00001), а вероятность того, что результаты анализа, выполненного одним методом,продемонстрируют нормальные значения, а при исследовании другим методом выявят повышенную ФДС – высокая (41%) [16]. В то же время ряд других исследований, со значительно меньшим объемом выборки, демонстрирует противоположный результат – высокую корреляцию результатов SCSA и TUNEL (коэффициент корреляции от 0,71 до 0,99) [25-27].

При этом, если мы обратимся к 3 исследованиям, использующим для оценки ФДС метод TUNEL, который применен в настоящем исследовании, то увидим, что их результаты так же не сопоставимы [16, 17, 23].

В наиболее крупном из представленных исследовании S. Belloc и соавт. изучалась корреляция уровня ФДС и стандартных параметров спермы у 1084 мужчин с изолированными формами патозооспермии (астенозо-оспермия, тератозооспермия, олигозооспермия). Корреляция отмечена только между уровнем ФДС и прогрессивной подвижностью сперматозоидов в группах с изолированной астено- и тератозооспермией. Кроме этого, высокий уровень ФДС (> 30%) достоверно чаще (p <0,00001) наблюдался у мужчин с астенозо-ооспермией (31%) по сравнению с пациентами с олиго-зооспермией (18%) и тератозооспермией (19%) [17].

Интересные данные получены в другом исследо-вании,где оценивалась связь между уровнем ФДС и жизнеспособностью сперматозоидов. Исходная выборка состояла из 50 пациентов с некрозооспермией и 20 пациентов с нормальным уровнем жизнеспособных сперматозоидов, что безусловно не позволяет экстраполировать результаты полученного исследования на мужскую популяцию в целом. Результаты исследования продемонстрировали сильную положительную связь доли нежизнеспособных сперматозоидов с уровнем ФДС (r = 0,878; p = 0,001). Кроме того, была выявлена статистически значимая отрицательная корреляция между уровнем ФДС и подвижностью сперматозоидов (r = – 0,646; р = 0,001), а также положительная корреля ция ФДС с долей морфологически аномальных сперма тозоидов (r = 0,434; р = 0,001) [23].

Определенный вклад в высокую вариабельность результатов исследований с использованием одного и того же метода оценки ФДС вносит отсутствие методо логической стандартизации методов оценки ФДС [28]. Из трех исследований, использующих для оценки ФДС метод TUNEL, только в одном применяли проточную цитометрию [17], два других исследования использо вали флюоресцентную микроскопию [16,23] для иден тификации разрывов ДНК.

В нашем исследовании не выявлено взаимосвязи уровня ФДС с возрастом мужчин, в то время как боль шинство исследований демонстрирует повышение уровня ФДС с увеличением возраста [29,30]. Получен ные результаты, вероятно, связаны с неоднородной воз растной структурой выборки – возраст 74% мужчин находился в диапазоне от 30-40 лет, 14% в интервале от 20 до 30 лет, 9% в возрасте от 40 до 50 лет и лишь у 3% был возрасте старше 50 лет. Существенным ограниче нием нашего исследования является то, что мы не вы являли факторы образа жизни (курение, потребление алкоголя, тепловые процедуры) и сопутствующую пато логию (варикоцеле, ожирение), которые потенциально могли повлиять на уровень ФДС и исказить результаты корреляционного анализа.

ВЫВОДЫ

Результаты нашего исследования демонстрируют взаимосвязь между уровнем ФДС и долей прогрес сивно-подвижных форм сперматозоидов. Тем не менее слабый характер выявленной взаимосвязи диктует не обходимость рассматривать исследование ФДС как са мостоятельный тест в оценке мужской фертиль ности.