Определение оптимальных доз ионизирующего излучения для инактивации возбудителя некробактериоза

Весьма перспективным при решении практических задач в биопромышленности является использование гамма-излучения при разработке технологий получения радиовакцин, радиоантигенов и других биологических препаратов [1].

Большинство используемых для профилактики и лечения инфекционных заболеваний бактериальные препараты готовят в особых условиях с соблюдением правил асептики, фильтруют через специальные фильтры [2], что сказывается на себестоимости препаратов и снижает их качество. Гамма-облучение позволяет проводить стерилизацию бактериологического материала в расфасованном виде, что позволяет исключить вероятность обсеменения во время ампулирования и фасовки. Радиационная стерилизация вакцин, как и иной биологической продукции, подразумевает применение доз, которые инактивировали бы высокорадиорезистентные бактерии и вирусы, но в то же время сохраняли антигенные и иммунногенные свойства препарата [4, 5].

Антигены, полученные в результате облучения гамма-лучами, имеют более высокую серологическую активность по сравнению с таковыми, полученными с использованием химических и физических (ультрофиалетовое облучение, ультразвуковая и механическая обработка, использование формалина) методов [3, 8].

Применение гамма-облучения в дозах, вызывающих полную инактивацию микроорганизмов, позволяет получить бруцеллезные, сапные, сибиреязвенные радиоантигены, а также радиовакцины против псевдобешенства, классической чумы свиней, бруцеллеза и сибирской язвы, которые используются по своему прямому назначению, а именно - для серодиагностики и иммунопрофилактики особо опасных болезней человека и животных [3, 5, 6, 9, 10].

В настоящее время проводятся исследования и имеются положительные результаты по получению и применению радиопротекторов микробного происхождения, полученных инактивацией гамма-облучением [1].

Методы сухой стерилизации, вызывающих полную инактивацию микроорганизмов, широко используются на предприятиях медицинской промышленности, производящих радиационно-стерилизируемую продукцию (одноразовые шприцы, медицинские инструменты, кетгут и пр.) [7].

Исходя из вышеизложенного, целью настоящих исследований явилось определение доз гамма-облучения, летальных для возбудителя некробактериоза.

Материал и методы исследований. В качестве объекта исследования использовали культуры F.usobacterium necroforum штамм 8TS630501, которую выращивали на жидкой питательной среде Китта-Тароцци с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота. Спустя 3 суток термостатирования, среду культивирования центрифугировали при 3000 об/мин в течение 40 мин, надосадочную жидкость декантировали, осадок доводили дистиллированной водой согласно эталону стандарта мутности, по Л.А. Тарасевичу, до 10 ед. (1 млрд/мл) и колоримет- рическим методом при помощи КФК-2 (светофильтр с длиной волны 540 нм), параллельно готовили мазки и окрашивали их по Граму для определения чистоты выращенной культуры.

Приготовленную взвесь разливали в стерильные флаконы емкостью 10, 50 или 100 мл, укупоривали их резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками, маркируя с указанием вида микроорганизма, дозы облучения и даты.

Облучение микробного материала осуществляли на гамма-установке «Исследователь», с источником 60Со, с мощностью экспозиционной дозы 3,7 кГр/час, используя междозовый интервал 5 кГр - 5, 10, 15, 20, 25, 30 кГр.

Степень инактивации гамма-облученных микроорганизмов определяли путем высева их на среду Китта-Тароцци. Параллельно ставили биопробу для определения жизнеспособности облученной бактериальной взвеси. Для этого использовали 72 белые мыши живой массой 18-20 г, которых заражали дробными дозами (по 4 мыши на дозу) выращенным материалом, подкожно в области крестца в объемах 0,2; 0,4; 0,6 см3. За посеянными пробами облученного бактериального материала вели ежедневный визуальный контроль, учитывали наличие или отсутствие роста, оценивали его интенсивность, фиксировали гибель зараженных белых мышей. С выращенных культур делали мазки, окрашивали их по Граму, микроскопировали под иммерсией с 90-кратным увеличением.

Результаты исследований. Интенсивность роста F.necrophorum представлены в Таблице 1.

Таблица 1 - Зависимость роста облученной культуры F.necrophorum от дозы гамма- облучения

Доза облучения (кГр)	Сроки исследований (час)
	24	48	72	96	120	144	168
5	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
10	+	++	+++	+++	+++	+++	+++
15	+	+	++	+++	+++	+++	+++
20	+	+	+	++	++	++	++
25	—	—	—	—	—	—	—
30	—	—	—	—	—	—	—
Контроль (необлученная культура)	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++

Условные обозначения: (-) - отсутствие роста; (+) - слабый рост; (++) - умеренный рост; (+++) - обильный рост.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что гамма-облучение культуры возбудителя некробактериоза в указанных диапазонах доз по-разному влияет на интенсивность ее роста. Радиационное воздействие в дозе 5 кГр не влияло на инкубируемый биологический материал, интенсивность его роста не отличалась от таковой в необлученной пробе. Введение взвеси микроорганизмов, подвергнутой облучению в указанной дозе, вызывало гибель всех зараженных белых мышей в период с 5 до 10 суток.

Влияние дозы гамма-облучения на интенсивность роста исследуемого биоматериала отчетливо проявлялось после высева возбудителя, облученного в дозах 10, 15, и 20 кГр. Так, если через 24 ч после воздействия радиационного фактора в ука- занных дозах интенсивность роста была слабой, то через 48 ч в образцах, подвергнутых облучению в дозе 10 кГр, – умеренной, а при дозах 15 и 20 кГр – слабой. Спустя 72 ч инкубации отмечался обильный рост культуры, подвергнутой воздействию ионизирующей радиации в дозе 10 кГр, и умеренный – при дозах 15 и 20 кГр.

Рост патогенного материала во временном интервале от 96 до 168 часов инкубации, был обильным в пробах, подвергнутых гамма-облучению в дозах 10 и 15 кГр, умеренным – при дозе 20 кГр (Рисунок 1). Зараженные материалом, облученным в дозах 15 и 20 кГр, белые мыши выживали в 20 и 40 % случаев, при 100 % гибели контрольных и зараженных культурой, облученной в дозе 10 кГр.

Рисунок 1 – Интенсивность роста культуры F.necroforum на 5 сутки после высева, облученного в дозе 20 кГр материала: слева опытный образец – задержка роста, справа контрольный – обильный рост.

После посева культуры, облученной в дозах 25 и 30 кГр, наступала абсолютная инактивация микроорганизмов, что подтверждалось отсутствием роста и гибели зараженных белых мышей.

В мазках, приготовленных из облученного материала, в поле зрения отчетливо наблюдали грамотрицательные длинные нити с густыми сплетениями и короткие тонкие нити, палочки с колбовидными утолщениями, характерными для изучаемой культуры.

Заключение. Полная инактивация возбудителя некробактериоза – F.necroforum штамм 8TS630501 наступает при облучении его в интервале доз 2530 кГр. Показано, что радиационное воз- действие в дозе 5 кГр, не влияет на рост возбудителя некробактериоза, ингибирование роста отмечается в образцах, подвергнутых облучению в дозе 10 кГр, и наиболее выражено при дозах 15 и 20 кГр.

докл. Всесоюз. научн. – практ. конф., по-свящ. 30-летию института. – Щелково. – 2000. – С. 231.

Резюме

Изучение радиорезистентности культуры Fusobacterium necroforum штамм 8TS630501 было проведено в отделе радиобиологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Облучение возбудителя некробактериоза проводили на гамма-установке «Исследователь», источник – 60Co с мощностью экспозиционной дозы 3,7 кГр/час в диапазонах доз от 5 до 30 кГр, с междозовым интервалом 5 кГр. Жизнеспособность облученной культуры определяли путем посева на питательную среду и постановкой биопробы на лабораторных животных.

Проведенными исследованиями установлено, что полная инактивация возбудителя некробактериоза наступает при облучении в интервалах от 25 до 30 кГр. Радиационное воздействие в дозе 5 кГр не влияет на рост данной культуры. Ингибирование роста облученного материала в дозах 10, 15 и 20 кГр, находится в прямой зависимости от степени радиационного воздействия, что подтверждается биопробой на лабораторных животных.