Определение параметров токсичности нового пробиотического препарата

Учитывая интенсивное развитие сельского хозяйства, регулярно возникает вопрос не только повышения продуктивности крупного рогатого скота, но, в первую очередь получение экологически чистого, безопасного, в санитарном плане, молока и продуктов его переработки [3, 2]. Ухудшение гигиенических условий содержания животных приводит к снижению качества молочной продукции, что выражается в увеличении бактериальной обсемененности и количества соматических клеток. Эти показатели являются индикаторами состояния здоровья вымени коров, которые в ближайшей перспективе могут негативно сказаться на снижении продуктивности и сортности молока [13].

К сожалению, традиционные средства защиты вымени коров от распространения нежелательной микрофлоры являются не столь эффективными. Они не решают проблему снижения распространения возбудителей мастита, поскольку количество коров, больных им в субклинической форме, в стаде доходит нередко до 30-60 %, а соматические клетки в молоке превышают 500-600 тыс./мл [1, 7]. Именно поэтому профилактика мастита является важной задачей в молочном скотоводстве [4].

В связи с этим, идет поиск новых средств, которые в будущем смогут уменьшить использование антибактериальных препаратов, направленных на лечение мастита, в молочном скотоводстве. Одними из которых, являются средства на основе пробиотических культур [6, 10]. Однако, все новые средства, которые будут применять в животноводстве, требуют тщательного изучения, и, в первую очередь, необходимо провести исследования безвредности для организма животных, и получаемой от них продукции [9, 8].

Исходя из вышесказанного, целью нашего исследования было проведение токсикологических исследований нового пробиотического препарата, предназначенного для обработки вымени лактирующих    коров    с    целью профилактики субклинического мастита.

В задачи наших исследований входило определение острой токсичности, раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаз, а также аллергезирующего воздействия изучаемого препарата.

Материал и методы исследований. Состав нового пробиотического препарата содержит штаммы микроорганизмов Bacillus subtilis и Bacillus amiloliquefaciens. Данный препарат необходимо использовать при обработке вымени после доения с целью профилактики заболевания крупного рогатого скота субклиническим маститом.

Опыты по определению острой токсичности были проведены на 50 клинически здоровых линейных белых крысах обоего пола, живой массой 180-200 г, разделенных на 5 групп (по 5 самцов и 5 самок в каждой); 4 группы – опытные и 1

группа – контрольные животные, находились в одинаковых условиях кормления и содержания с соблюдением всех зоогигиенических условий. Всего было исследовано по 4 дозы новых пробиотических препаратов. Отправным моментом для поиска дозы служили известные данные аналогичных пробиотических препаратов. Крысам контрольной группы перорально вводили дистиллированную воду в объеме 5 мл. Животным опытных групп пробиотический препарат растворяли в воде и, перорально с помощью зонда с оливой на конце, первой опытной группе вводили в дозе 3000 мг/ кг, второй – 4000 мг/кг, третьей – 5000 мг/кг и четвертой группе – 6000 мг/кг массы тела в объеме 5 мл после 12 часовой голодной выдержки, длительность наблюдения составляла 14 суток [5].

Дальнейшее изучение было направлено на определение раздражающего и аллегезирующего действия нового пробиотического препарата на лабораторных кроликах, живой массой 3,3-3,5 кг. Для этого участки кожи 5x5 см за день до эксперимента тщательно выстригли на спине слева, и справа от позвоночника. На шею кроликов надевали пластиковые воротники для исключения слизывания испытуемого пробиотического препарата. Испытуемый пробиотический препарат наносили на выстриженный участок кожи в нативном виде из расчета 20 мг/см2 и объемом 0,2 мл справа от позвоночника, контроль – 0,2 мл дистиллированной воды слева от позвоночника, время экспозиции составляло 4 часа, после чего нанесенный препарат удаляли теплой водой с мылом. После смыва реакцию кожи регистрировали через 1 и 18 часов, оценивали в сравнении с симметричными участками кожи того же животного, где была нанесена дистиллированная вода. Наблюдение за кроликами вели в течение 7 дней [5].

При определении раздражающего действия на слизистую оболочку глаз, в опыт были взяты 4 кролика, для чего в конъюнктивальный мешок левого глаза кроликов вносили испытуемый пробиотический препарат в количестве 2 капель, а правый глаз служил контролем, куда вместо препарата вносили дистиллированную воду в аналогичном количестве. После внесения препарата на 1 минуту, прижимали слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза. Наблюдение за состоянием слизистой оболочки и прозрачностью роговицы проводили в течение одной недели [5].

Для определения аллергезирующего действия на 4-х кроликах им выстригали участки кожи (5×5 см) на спине, слева и справа от позвоночника. Правый бок служил для аппликации раствора, изучаемого пробиотического препарата, а левый – для контроля (дистиллированная вода). Испытуемый пробиотический препарат наносили на выстриженный участок кожи в нативном виде из расчета 20 мг/см2 и объемом 0,2 мл справа от позвоночника, контроль – 0,2 мл дистиллированной воды слева от позвоночника. Эксперимент проводился в течение 30 дней, т.е. ежедневно на выстриженный участок кожи наносили испытуемый пробиотический препарат и дистиллированную воду [5].

Доклинические испытания были проведены при строгом соблюдении всех требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных целей».

Результат исследований. Опыты по определению острой пероральной токсичности нового пробиотического препарата проводили на лабораторных линейных крысах по методу Кербера, а результаты, полученные в ходе эксперимента, приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Исследование острой токсичности пробиотических препаратов

Из данных таблицы следует, что при пероральном введении нового пробиотического препарата, используемого после доения, в дозах от 3000 до 6000 мг/кг, не наблюдалось гибели лабораторных крыс. В течение эксперимента с крысами, получающими 3000 и 4000 мг/кг массы тела, общее состояние, поведенческие реакции, нервно-мышечная возбудимость были в пределах физиологической нормы. В первые часы после введения 5000 и 6000 мг/кг (максимально возможная допустимая доза) массы тела, у крыс отмечали некоторое угнетение, отказ от корма, движение животных замедлилось. Спустя 3-4 часа эти клинические признаки нормализовались и были идентичны контрольным крысам. При введении всех доз изменения со стороны шерстного покрова не были отмечены. В период исследования гибели животных не наблюдали. Ввиду этого, среднесмертельную дозу определить не удалось.

При изучении раздражающего действия, заявляемого пробиотического препарата на кожу, каких-либо функциональных нарушений отмечено не было, и она не отличалась от контрольного участка.

В опытах с пробиотическим препаратом, как и у опытных, так и у контрольных кроликов отека слизистой оболочки глаз не наблюдалось, роговицы глаз были чистые. Однако, в отличие от контроля спустя 2-3 часа после нанесения препарата у опытных кроликов отмечалась небольшая гиперемия слизистой оболочки, исчезающая через 1-1,5 часа.

Данные опыта показывают, что испытуемый пробиотический препарат является веществом, не вызывающим сильного раздражения слизистых оболочек глаз опытных кроликов.

За период проведения опыта, явных аллергических реакций не отмечено, за исключением некоторого покраснения, начиная с 28 дня на месте нанесения препарата, которые исчезали через 3 часа после нанесения препарата в этот же день у опытных животных. Исходя из этого, испытуемый пробиотический препарат можно отнести к веществам, не вызывающих аллергических реакций.

Изучая особенности токсического действия нового пробиотического препарата на внутренние органы, была проведена детальная патологоанатомическая аутопсия, согласно методике вскрытия и извлечения органов лабораторных животных (крысы), при этом обращали внимание на размеры внутренних органов, их кровенаполнения, и на наличие патологических очагов.

При проведении макроскопической оценки можно заключить, что лимфатические узлы не увеличены, без кровоизлияний, правильной формы. Легкие, бронхи без патологических изменений, имеют правильную анатомическую конфигурацию. Сердце, околосердечная сумка не увеличены в размере, гиперемия отсутствует. Печень имеет правильное анатомическое расположение, увеличения в размере не наблюдается. Желудок правильной формы, отечности и следов кровоизлияний на слизистой оболочке не отмечено. Все отделы кишечника были без изменений.

Заключение. Таким образом, анализируя вышесказанное можно заключить, что пероральное введение нового пробиотического препарата в максимально возможной вводимой дозе (до 6000 мг/кг) не вызвало интоксикацию и гибель среди опытных животных, что согласуется с литературными данными [11, 12]. Руководствуясь данным гигиенической классификации по основным параметрам вредности данные препараты относятся к нетоксичным соединениям, а по степени опасности ГОСТ 12.1.007-76 – к 4 классу.