Определение радиорезистентности вакцинного штамма B. abortus 82 к гамма - облучению

В ФГБНУ  «ФЦТРБ-ВНИВИ»

велись    и    ведутся    интенсивные исследования по    конструированию радиоинактивированных антигенов и радиовакцин             бактериального происхождения, в частности против особо опасных болезней человека и животных, т.е. антропозоонозов.

Радиомикробиологические исследования в этой области, проведенные [1] и продолженные [2,  3], показали принципиальную возможность получения высокоактивных    и    специфичных радиоантигенов возбудителя бруцеллеза для проведения серологического анализа при бруцеллезе. Работами [4, 5] была заложена принципиальная возможность получения       радиоинактивированной вакцины против бруцеллеза животных и впервые на практике была применена радиовакцина       против       этого зооантропоноза.

Продолжая   исследования по получению радиовакцин [6,  7] была проведена серия исследований по изготовлению гамма-инактивированных противобруцеллезных вакцин для мелкого рогатого скота. В результате проведенных исследований авторами впервые получены радио-инактивированные вакцины из штаммов бруцелл B. abortus 82, B. melitensis Rev-1 и вирулентного штамма B. suis 86, наиболее высокоиммунной оказалась радиовакцина из штамма B. abortus 82 [6].

Целью наших исследований стало определение необходимых доз гамма-лучей для полной инактивации бруцелл при высоких концентрациях тест-микроба (0,5-10,0×106 м.к./см3).

Материал и методы исследований. Для получения радиорезистентных мутантов бруцелл, вакцинный штамм B. abortus 82 подвергали воздействию гамма-лучей на установке «Исследователь» с источником излучения 60Со с экспозиционной мощностью 14 кГр/ч в дозах 5, 10, 20, 30, 35, 40 кГр. Облученные культуры высевали на агар по мере уменьшения роста с возрастанием дозы облучения, единичные колонии отсевали на свежие косячки агара, такие последовательные пересевы и облучение в возрастающих дозах гамма-лучей проводили до тех пор, пока бруцеллы не достигали максимальной степени резистентности к гамма-лучам. Устойчивые к определенным дозам ионизирующих излучений культуры бруцелл ставили на агаровые пластинки для получения изолированных колоний и определяли у последних резистентность к более высоким дозам гамма-лучей.

На первом этапе, перед проведением основной работы данного этапа – получения радиорезистентного мутанта с целенаправленной изменчивостью бруцелл путем переключения метаболизма, проводили исследования по изучению радиорезистентности исходного штамма бруцелл – B. abortus 82.

При проведении настоящих исследований мы исходили из того, что не только различные виды микроорганизмов, но и различные штаммы одного и того же вида микроорганизмов обладают различной радиорезистентностью, что имеет важное значение, как для радиоинактивации микроорганизмов при получении радиовакцин, так и для получения мутантов, обладающих различной иммуногенностью [7, 8]. Радиорезистентность одного и того же штамма определенного вида микроорганизмов зависит от концентрации микробных клеток в облученной пробе, от температуры взвесей в облучаемой камере, от наличия во взвеси микроорганизмов, химических или биологических агентов (рН среды, наличие белковых компонентов во взвеси облучаемых проб микроорганизмов).

С учетом вышеуказанных сопутствующих или спонтанно присутствующих факторов при радиомикробиологических исследованиях по изучению радиорезистентности бруцелл мы использовали такие критерии, как концентрация облучаемых бруцелл, так и их штаммовую разновидность. При проведении настоящих исследований мы руководствовались Правилами радиационной микробиологии, разработанными ИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи АМН СССР (1962). Согласно указанным Правилам, для конкретизации дозы облучения необходимо испытать радиоустойчивость не менее 3-х штаммов одного вида микроорганизмов. Поэтому, для изучения радиорезистентности бруцелл, в своих радиомикробиологических исследованиях мы использовали 5 видов штаммов B. abortus (19, 54, 99, 82, R-1096), находящихся в S-, R- и SR-формах.

Для изучения радиорезистентности бруцелл указанных видов, культуры вышеуказанных штаммов, выращенные на плотной питательной среде, смывали стерильным физиологическим раствором и готовили суспензии с концентрацией 1×109 м.к./см3, далее получали 10-кратные разведения культур, переносили их в стерильные флаконы (200 см3), закрывали резиновыми пробками и подвергали гамма-облучению при экспозиционной дозе 437,4 Р/ч, при неравномерности дозного поля не более 10%. Радиационному воздействию культуры бруцелл подвергали путем размещения их в зону облучения на время, за которое облучаемый объект получит заданную дозу.

Работа проводилась в строгом соответствии с нормами радиационной безопасности (НРБ). Для облучения использовали различные дозы гамма-квантов от 2000 до 10 000 Гр, время облучения измерялось с 30 мин до 2,5 r. В связи с особенностями методического приема (определения Д 10 и Д 100 ), каждой концентрации бруцелл соответствовал свой интервал доз облучения.

Для определения числа микробных клеток, выживших после облучения, чашки Петри с высевами из облученных суспензий помещали в термостат при плюс 37 ⁰С на 5 сут, по истечении указанной экспозиции подсчитывали число выросших колоний. Во всех случаях были рассчитаны средние арифметические логорифмы живых микробов и стандартные ошибки. Для количественной оценки радиорезистентности микробов, облученных гамма-лучами, определяли Д 10 (доза облучения, уменьшающая число микробов в 10 раз) по формуле, представленной в работе М.А.Туманяна и А. Каушанского (1974):

D10-D/Lg So-LgS1, где D – доза облучения, So и S1 – число живых микробов до и после облучения в дозе D.

Результат исследований.

Получены результаты сравнительных радиомикробиологических исследований по определению радиорезистентности различных штаммов бруцелл в зависимости от вирулентности и нахождения их в R-, SR- или S-форме (Таблица 1).

Значения D10 различных штаммов B. abortus колебались в пределах от 6,97±0,21 до 7,89±0,33. При этом для S-форм этот показатель был примерно одинаковым и составлял 6,97±7,01 Гр, в то время как для R-форм эти значения составляли 7,7 ± 7,89 Гр, что на 11 % больше, чем для S-формы бруцелл. По радиорезистентности SR-формы бруцелл занимали промежуточные положения и D10 для них равнялась 7,3±0,28 Гр, т.е. по изучаемому показателю они недостоверно отличались от такового и S- и R-форм бруцелл.

Таблица 1 – Радиорезистентность различных штаммов бруцелл к гамма-лучам 60Со

Штаммы бруцелл	Дозы гамма-лучей, вызывающих гибель 10 % бруцелл (D 10 ), Гр
B.abortus	0	31	62	125	250
19	8,03±0,1	6,97±0,21	6,45±0,47	6,07±0,15	5,49±0,21
54	8,0±0,3	7,7±0,10	6,49±0,31	6,15±0,3	6,15±0,12
99	8,01±0,1	7,01±0,35	6,25±0,39	6,26±0,45	6,02±0,9
82	8,1±0,1	7,3±0,25	6,05±0,25	6,25±0,25	6,0±0,29
R-1096	8,0±0,2	7,8±0,33	6,31±0,9	6,31±0,9	6,07±0,13

После установления степени радиорезистентности различных штаммов бруцелл, проводили исследования по определению доз, вызывающих гибель микробной популяции – полную инактивацию бруцелл. Учитывая, что все испытанные штаммы имели почти одинаковую радиорезистентность, дальнейшие опыты по определению летальных доз гамма-лучей на бруцелл проводили со штаммом B. abortus 82. Для определения летальных доз гамма-лучей на тест-микроб были приготовлены различные концентрации (от 0,5 до 20 млрд м.к./см3), которые подвергали воздействию гамма-облучения в дозах 5; 5,5; 6,0; 6,5; 7,5; 8,0 Гр (Таблица 2).

Таблица 2 – Зависимость радиоинактивации бруцелл от концентрации микробов в облучаемой суспензии

Конц. бруцелл м.к./см3	Выживаемость бруцелл (%) при облучении в дозах, кГр
	5,0	5,5	6,0	6,5	7,5	8,0
0,5×106	20,1	11,3	7,9	-	-	-
1,0×106	22,5	12,5	8,1	1,7	-	-
2,0×106	27,7	13,7	8,5	1,9	0,1	-
4,0×106	35,3	14,9	9,1	2,0	0,3	-
8,0×106	47,9	15,1	9,9	2,51	0,5	-
10,0×106	55,5	13,7	10,5	2,83	0,00015	-
20,0×106	61,3	17,1	12,3	2,5	0,001	-

Степень радиоинактивации бруцелл зависит от концентрации микробов, содержащихся в микробной суспензии. Так, для полной инактивации бруцелл при их концентрации в суспензии 0,5×106 м.к./см3 необходимо использовать дозу гамма-лучей 6,5 кГр.

При двукратном повышении концентрации бруцелл в облучаемой суспензии (10×106м.к./см3), для полной инактивации тест-штамма необходимо использовать дозу гамма-лучей 8,0 кГр, что превышает предыдущую дозу в 1,17 раза, т.е. повышение концентрации бруцелл в облучаемой суспензии обусловливает повышение радиорезистентности бруцелл.

Заключение. Стерилизующий (инактивирующий) эффект облучения зависит, как от дозы, так и от густоты и объема облучаемой взвеси, т.е. между концентрацией микробов и дозой, инактивирующей 100 % клеток, существует прямая пропорциональная зависимость:   чем меньше густота облучаемой взвеси, тем меньше доза облучения,       дающая      полный бактерицидный эффект.

Следовательно, при изготовлении противобруцеллезных       радиовакцин необходимо учитывать степень густоты облучаемой     вакцины,     поскольку концентрация микробов в вакцинах бывает различной: от 1×109 до 20 ×109 м.к./см3.

Проведенное        исследование показало, что для полной инактивации бруцелл при высоких концентрациях тест-микроба       (0,5-10,0×106      м.к./см3)

необходимы дозы гамма-лучей порядка 8,0 кГр.