Определение содержания водорастворимых и жирорастворимых пищевых красителей в рыбной икре методом ВЭЖХ

Согласно определению Технического регламента Таможенного союза, «Краситель – пищевая добавка, предназначенная для придания, усиления или восстановления окраски пищевой продукции [5]. В Кодексе Алиментариус представлена международная система нумерации пищевых добавок, в которой красители занимают номера от Е100 до Е199 [8].

Красители широко используются в пищевой индустрии. Чаще всего они применяются для улучшения органолептических свойств, для придания яркого цвета продуктам с невыраженной окраской, либо для восстановления окраски, утерянной при обработке продукта [5]. В случае с рыбной икрой окрашивание может быть использовано для фальсификации икры ценных пород рыб менее ценными образами икры, либо имитацией икры.

Для пищевой промышленности разработаны около сотни различных красителей, как природных, так и синтетических, однако не все из них являются безопасными и разрешенными для применения. В мировой практике каждое государство устанавливает список разрешенных к применению красителей и уровни допустимых концентраций этих веществ в различных продуктах питания. На территории Евразийского экономического союза эти требования приведены в ТР ТС 029/2012.

Все красители, применяемые в пищевой промышленности, можно разделить на три группы: натуральные красители (или основанные на натуральных), синтетические, неорганические [6].

Натуральные красители [9, 11], оказывают, как правило, преимущественно положительное влияние на здоровье потребителя, так как обладают антиоксидантными свойствами и содержатся в натуральных овощах, фруктах и ягодах. Но, важно отметить, они могут вызвать аллергические реакции, расстройства пищеварения и другие негативные последствия для здоровья человека при повышенных концентрациях или индивидуальной непереносимости.

Неорганические красители из-за недостаточных исследований их опасности слабо регулируются законодательством, их предельно допустимое содержание не определено, допускается их добавление, согласно технической документации [5]. Однако существуют данные о токсичности этих веществ [13].

Наиболее широко представлена группа синтетических красителей, так как их создание не ограничено наличием подобных веществ в природе, они имеют наиболее яркую и разнообразную окраску, придают продуктам оригинальный внешний вид, значительно улучшая их органолептические свойства. Все синтетические красители, разрешенные к применению согласно ТР ТС 029/2012, прошли процедуру подтверждения их безопасности в рамках допустимых пределов уровней концентраций. Тем не менее, необходимо проводить жесткий контроль их количественного содержания во всех продуктах питания, где это предусмотрено нормами регламента, так как доказана связь между серьезными психическими [10] и физическими [7, 12] нарушениями и чрезмерным употреблением продуктов питания, окрашенных синтетическими красителями. Наблюдались СДВГ (синдром дефицита внимания и гиперактивности), депрессия, тревога, асоциальное поведение, нарушения функции эндокринной и нервной систем.

Статья посвящена разработке методики определения количественного содержания красителей в икре рыб. Актуальность работы обусловлена тем, что икра – важный продукт во многих национальных кухнях, он, как и многие другие пищевые продукты может подвергаться окрашиванию, как в целях создания ярких блюд, так и в целях фальсификации. В икре, согласно ТР ТС 029/2012 регламентировано содержание различных красителей, как натуральных, так и синтетических не более 300 мг/кг по отдельности, или в комбинации. Несмотря на установленные нормы, на территории Российской Федерации не проводится мониторинг пищевых красителей в рыбной икре, так как отсутствуют аттестованные методики измерения.

Существующие методики определения красителей распространяются на конкретные продукты питания, не включающие икру рыб и продукты из нее. Кроме того, эти методики охватывают не полный перечень веществ, подлежащих контролю и в большинстве нормативных документов, включают в себя только синтетические красители [1-4].

Материал и методы исследований. В работе применялся метод исследования – высокоэффективная жидкостная хроматография с диодноматричным детектором. Этот метод основан на разделении веществ путем перераспределения их между двумя несмешиваемыми фазами: твердой неподвижной фазой (сорбент в хроматографической колонке) и подвижной фазой (эллюент). Детектирование аналитов осуществляют по способности к поглащению света на определенных длинах волн, диодноматричный детектор способен измерять поглощение на нескольких длинах волн одновременно. Количественный анализ проводят по корреляции концентрации вещества и площади пика сигнала.

При разработке методики измерений был использован жидкостный хроматограф Agilent 1200, весы лабораторные DISCOVERY DV 214C специального класса точности с пределом взвешивания 0,1 мг, центрифуга Thermo Fisher Scientific SL 40R, шейкер для пробирок Multi Reax II, дозаторы механические 1-канальные, BIOHIT Proline Plus варьируемого объема (1000-10000 мм3; 100-1000 мм3; 10-100 мм3; 20-200 мм3; 0,5-10 мм3).

Применялись стандартные образцы следующих пищевых красителей: бриллиантового черного, красного очаровательного, бета-апо-8-альдегида, кислотного желтого, образец кислотного зеленого, быстрого зеленого, кармина, шоколадного коричневого, куркумина, лютеина, бриллиантового голубого, кислотного синего, понсо 4R, желтого «солнечного заката», тартразина, кармоизина, индигокармина, ликопина.

Для определения метрологических характеристик получали результаты измерений красителей в образцах икры рыб с введенными добавками красителей. Всего для каждого аналита проводили 4 эксперимента с 6 параллельными определениями разными операторами в разные дни. Эксперимент проводили на 4 уровнях концентраций: 10 мг/кг, 50 мг/кг, 300 мг/кг и 400 мг/кг.

Результат исследований. Так как пищевые красители являются веществами с различными физико-химическими свойствами, определение всех заявленных аналитов в рамках одной методики затруднительно, поэтому все исследуемые соединения были разделены на водорастворимые красители и жирорастворимые красители.

Идентификацию водорастворимых красителей проводили в зависимости от цвета при различных длинах волн:

• -      Синий     патентованный,

Индигокармин,    Синий    блестящий,

Зелёный S, Черный блестящий – 610 нм.

• -    Зелёный прочный FCF– 300 нм.

• -    Тартразин, Хинолиновый жёлтый, Жёлтый «солнечный закат» – 420 нм.

• -    Коричневый HT – 460 нм.

• -    Азарубин, Понсо 4R, Красный очаровательный, Кармин – при длине волны 510 нм.

Были                подобраны хроматографические параметры для методики:

• -    температура колонки – 40 °С;

• -    скорость потока подвижной фазы – 1,5 см³/мин;

• -    объем вводимой пробы – 10 мм³.

Подвижная фаза А: 1,5 % раствор ацетата аммония в воде.

Подвижная фаза Б:   раствор метанол: ацетонитрил в соотношении 50 к 50.

Условия градиентного элюирования красителей представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Градиент подвижных фаз

Время, мин	Концентрация A, %	Концентрация Б, %
0	95	5
1	95	5
30	10	90
35	10	90
40	95	5

Для экстракции красителей из икры применяли следующую процедуру:

Взвешивали 1,0 г гомогенизированной рыбной икры в центрифужной пробирке объемом 50 см3, добавляли 5 см3 деионизированной воды, 5 см3 метанола и 5 см3 гексана, встряхивали на шейкере в течение 10 мин. Далее содержимое пробирок центрифугировали при скорости 4000 об/мин. Гексановую фракцию отбрасывали, остальную жидкость переливали в новую полипропиленовую пробирку объемом 15 см3. Полученный собранный супернатант разбавляли в 3 раза водно-метанольным раствором (1:1) и использовали для ВЭЖХ анализа.

Для разделения жирорастворимых красителей (бета-апо-8-каротиновый альдегид, куркумин, ликопин, лютеин) были подобраны следующие условия:

• -    длина волны детектора: 463 нм

• -    колонка: обратная фаза C18 250 x 4,6 мм, 5 мкм.

Методика приготовления подвижной фазы: в мерную колбу емкостью 1000 мл приливают 25 см3 0,2 % водного раствора ацетата аммония, 470 мл ацетонитрила и 350 см3 метанола. Смесь нагревают до комнатной температуры и доводят до метки метанолом.

• -    Изократическое элюирование.

• -    Температура колонки: 30°.

• -    Скорость потока: 0,6 мл/мин.

• -    Объем инъекции: 10 мкл.

• -    Время анализа: 30 мин.

Методика       пробоподготовки жирорастворимых     красителей:     с точностью до 0,01 г взвешивали 1,0 г образца гомогенизированной пробы, переносили в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводили до метки тетрагидрофураном. Смесь тщательно перемешивают. 100 мм3 полученного экстракта помещают в колбу на 100 мл и доводят до метки ацетонитрилом. После перемешивания экстракт используют для ВЭЖХ анализа.

Количественное      определение водорастворимых и жирорастворимых красителей проводили методом матричных градуировок, для которых сначала готовили растворы исходных красителей. Для      приготовления      исходного стандартного раствора рассчитывали массу навески вещества (мг), эквивалентные 100,0 мг соответствующего красителя, в мерной колбе объёмом 10 мл по формуле:

юо м in = 10,

Pl ^анал1гта где P – массовая доля основного вещества в стандартном образце, %

M – молярная масса основного вещества в стандартном образце, г/моль M аналита – молярная масса аналита, г/моль

Для приготовления исходного стандартного раствора C0 каждого красителя в мерную колбу объёмом 10 мл, вносили рассчитанные массу красителя, приливали 8 см3 растворителя, согласно таблице 2 и перемешивали. После чего доводили колбу до метки.

Таблица 2 – Растворители для приготовления растворов стандартных образцов исследуемых красителей

Наименование красителя	Растворитель
Азарубин	вода
Красный очаровательный	вода
бета-апо-8-каротиновый альдегид	тетрагидрофуран
Желтый «Солнечный закат»	вода
Желтый хинолиновый	вода
Зеленый S	вода
Зеленый прочный	вода
Индигокармин	вода
Кармин	вода
Коричневый HT	вода
Куркумин	ацетон
Ликопин	ацетон
Лютеин	ацетон
Понсо 4R	вода
Синий блестящий	вода
Синий патентованный	вода
Тартразин	вода
Черный блестящий	вода

Из исходных растворов красителей С 0 готовили отдельно смеси водорастворимых красителей (С 1в, С 2в ) и жирорастворимых красителей (С 1ж, С 2ж ) с концентрацией каждого аналита 1 мг/см³ и 0,1 мг/см³.

Матричные градуировочные растворы водорастворимых красителей (G 1в -G 5в ) готовили в полипропиленовых пробирках объёмом 15 мл, в который вносили 1,0 г чистой гомогенизированной пробы икры и растворы красителей С 1в и С 2в : G 1в (10 мг/кг), G 2в (50 мг/кг), G 3в (75 мг/кг), G 4в (100 мг/кг), G 5в (400 мг/кг).

Далее образцы подвергаются пробоподготовке, аналогично с тестируемыми образцами икры.

Матричные градуировочные растворы жирорастворимых красителей

(G 1ж -G 5ж ) так же готовили в полипропиленовых пробирках объёмом 15 мл куда вносили 1,0 г чистой гомогенизированной пробы икры и растворы красителей С 1ж и С 2ж : G 1ж (10 мг/кг), G 2ж (50 мг/кг), G 3ж (75 мг/кг), G 4ж (100 мг/кг), G 5ж (400 мг/кг).

Далее образцы подвергаются пробоподготовке, аналогично с тестируемыми образцами икры.

Метрологические характеристики методики определяли с помощью проб икры мойвы и горбуши с добавлением определяемых веществ на уровнях концентрации 10 мг/кг, 50 мг/кг, 300 мг/кг и 400 мг/кг. В таблице 3 представлены определенные характеристики для описанных методик определения красителей в икре для каждого аналита.

Таблица 3 – Метрологические характеристики определения пищевых красителей в икре методом ВЭЖХ

Аналит	Диапазон методики, мг/кг	Значение относительной расширенной неопределенности, ± U, %	Предел повторяемости, r, %
Азарубин	10-400	10	17
Красный очаровательный	10-400	10	16
Тартразин	10-400	9	13
Желтый «Солнечный закат»	10-400	9	14
Желтый хинолиновый	10-400	9	12
Зеленый S	10-400	10	13
Зеленый прочный	10-400	9	16
Индигокармин	10-400	9	12
Кармин	10-400	10	17
Коричневый HT	10-400	9	19
Черный блестящий	10-400	9	12
Синий патентованный	10-400	9	13
Синий блестящий	10-400	9	16
Понсо 4R	10-400	9	13
Лютеин	10-400	10	14
Ликопин	10-400	10	13
бета-апо-8-каротиновый альдегид	10-400	9	14
Куркумин	10-400	10	17

По результатам эксперимента были получены стабильные результаты на диапазоне концентраций от 10 мг/кг до 400 мг/кг. Полученный диапазон определения красителей включает в себя норму допустимого содержания этих веществ согласно ТР ТС 029/2012, следовательно, методики могут быть применены для контроля икры на соответствие требованиям Евразийского экономического союза.

Заключение. Были разработаны методики определения водорастворимых и жирорастворимых красителей в икре рыб методом ВЭЖХ. Актуальность разработки этих методик обусловлена требованиями ТР ТС 029/2012, в которых определены максимальные уровни концентраций пищевых красителей в икре и отсутствием аналогичных методик в Российской Федерации.

Новые методики направлены на повышение уровня контроля качества и безопасности икры рыб на территории России и конкурентоспособности российской продукции на мировом рынке.