Оптимальные питательные среды для выращивания штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis антагониста возбудителя белой гнили

Введение. Вредоносной болезнью многих сельскохозяйственных культур, в т. ч. и масличных (подсолнечника, сои и озимого рапса), является белая гниль ( Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary). Основной запас инфекционного начала возбудителя белой гнили сохраняется на растительных остатках и в почве в виде склероциев.

Использование организмов-интродуцентов – один из наиболее известных и широко распространенных путей применения биологического метода защиты растений от болезней, вызываемых грибами. Микроорганизм, пригодный для получения эффективного биопрепарата, должен проявлять антагонистическую активность против патогенов в широко варьируемых условиях. Во многих странах ведутся поиски таких микроорганизмов, проводятся испытания их в полевых условиях, результаты которых показывают перспективность подобных исследований [1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9].

Микробиологических препаратов для снижения запаса инфекционного начала возбудителей болезней в почве и на растительных остатках чрезвычайно мало. Поэтому создание новых высокоэффективных эколо- гически безопасных микробиопрепаратов на основе штаммов, снижающих жизнеспособность склероциев белой гнили, является актуальной задачей.

В результате ступенчатого скрининга грибов и бактерий из коллекции антагонистов возбудителей болезней масличных культур лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю белой гнили озимого рапса отобран от-селектированный штамм Xk-1-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis, наиболее активно разлагающий склероции возбудителя болезни.

В целях разработки элементов технологического регламента производства биопрепарата на основе перспективного штамма гриба-антагониста Xk-1-4 Chaetomium oliva-ceum определяли оптимальные питательные среды для штамма продуцента в условиях стационарного и глубинного культивирования.

Материалы и методы. Для определения оптимальных питательных сред из естественных субстратов для выращивания штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum субстрат промывали, размельчали, помещали в колбы Эрленмейера объёмом 750 мл, заполняя 70 % объёма, стерилизовали в автоклаве в течение часа при давлении 1,5 атм., засевали спорами и мицелием гриба и помещали в термостат с температурой 25 ^оС. Учёт проводили через 10 суток культивирования. Учитывали рост мицелия, интенсивность спорообразования, образование плодовых тел. Субстрат с выращенным грибом вытряхивали из колб, просушивали при температуре 30-35 ^оС в течение 4 суток, размалывали на шаровой мельнице до величины частиц 60 мкм и определяли титр лабораторного образца микробиопрепарата. Для этого готовили ряд последовательных разведений. 1,0 г препарата помещали в колбу со стерильной дистиллированной водой (90 мл), тщательно перемешивали, доводили объем до 100 мл и ставили на качалку на 10 минут. Разведение препарата, или его концентрация в приготовленной суспензии, составляло 10^-2. Предварительно стерильную дистиллированную воду разливали по 9,0 мл в стерильные сухие пробирки. Затем отбирали 1,0 мл суспензии и переносили в пробирку с 9,0 мл стерильной воды. Полученное разведение 10^-3 тщательно перемешивали. Таким же образом готовили все последующие разведения до 10^-8. При приготовлении использовали каждый раз отдельные стерильные мерные колбы, пипетки и пробирки.

Для определения титра использовали разведения 10-7 и 10-8. Для этого суспензию по

1,0 мл из соответствующего разведения переносили в три стерильные чашки Петри. Затем в эти чашки заливали по 15-20 мл агаризиро-ванной среды, остуженной до 45-50 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными движениями, после чего чашки оставляли на горизонтальной поверхности до застывания среды. Чашки Петри ставили в термостат с оптимальной температурой и через 3-5 суток инкубации подсчитывали среднее число колоний в трёх повторностях.

Титр (количество колониеобразующих единиц в 1,0 г препарата) вычисляли по формуле:

Т = a х 10n , V где Т – количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 г;

• а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;

• V – объем суспензии, взятый для посева; 10ⁿ – коэффициент разведения.

Подбор оптимальных искусственных сред и условий культивирования на них перспективного штамма антагониста проводили на жидких питательных средах Чапека, Тайло-на-3 и Рудакова при стационарном и глубинном культивировании. Предварительно посевной материал выращивали на агаризо-ванной питательной среде – картофельно-сахарозном агаре (КСА). Учитывали накопление биомассы, образование спор, плодовых тел . Выращивание проводили при оптимальной температуре 25 °С. Учёты роста мицелия и образования плодовых тел проводили через 3, 5 и 10 суток культивирования.

Глубинное культивирование штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum осуществляли на круговой качалке с оборотом двигателя 200 об./мин в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл при объёмах среды 150 мл при температуре 25 ^оС в течение 4 суток.

Результаты и обсуждение. Грибы рода Chaetomium обычно встречаются в почве и в органическом компосте, способны разлагать целлюлозу и другие органические вещества, проявляют антагонистические свойства к различным микроорганизмам почвы [10; 6].

Гриб относится к классу Ascomycetes, порядку Sphaeriales, семейству Chaetomiaceae.

Гриб – аэроб. Ранее установлено, что наиболее благоприятным для роста мицелия и образования плодовых тел является выращивание гриба на картофельно-сахарозном агаре при температуре 25 °С. При выращивании на искусственных питательных средах (среда

Чапека) штамм Хk-1-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis ассимилирует сахарозу, крахмал, в средней степени – глюкозу и в слабой степени – маннит. Из источников азота использует нитратный, аммонийный азот, мочевину, в слабой степени – тиомочевину. Оптимальный уровень рН среды – 6 [6].

Определение оптимальной питательной среды для штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum из естественных субстратов

Всего для выращивания штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum было использовано тринадцать естественных субстратов (табл. 1).

Таблица 1

Рост штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum на естественных субстратах при температуре 25 °С через 10 суток

Краснодар, ВНИИМК

Среда	Рост мицелия, балл*	Образование плодовых тел, балл**	Титр порошка, КОЕ/г
Силос	3	1	1,8 × 109
Солома	5	2	2,0 × 109
Сено	5	2	3,8 × 109
Опилки	2	1	6,0 × 106
Жом	2	1	9,0 × 103
Комбикорм	4	2	3,6 × 109
Сенаж	0	0	0
Семянки подсолнечника	5	2	6,5 × 109
Лузга подсолнечника	5	2	3,0 × 109
Лузга + семянки (1:3)	5	2	6,4 × 109
Лузга + семянки (1:1)	5	2	4,6 × 109
Лузга + гумат натрия 0,1 %	5	2	4,2 × 109
Лузга + гумат натрия 0,2 %	5	2	5,0 × 109
Лузга + гумат натрия 0,3 %	5	2	6,6 × 109
Порошок лузги + кукурузный экстракт	5	2	8,0 × 109
Отходы от очистки семян подсолнечника	5	2	3,9 × 109
Отходы + гумат натрия 0,2 %	5	2	7,3 × 109
Кукурузная мезга	5	2	6,0 × 109
Отходы от очистки семян рапса	4	2	2,6 × 106
Отходы от очистки семян горчицы	0	0	0

* рост мицелия в баллах (зарастание поверхности среды): 1 – до 10 %; 2 – до 30 %;

3 – до 50 %; 4 – до 75 %; 5 – до 100 %.

** образование плодовых тел в баллах:

0 – отсутствие плодовых тел; 1 – единичные;

2 – массовое количество .

Установлено, что наиболее благоприятными из испытанных естественных субстратов являлись среды на основе семянок и лузги подсолнечника с различными добавками, отходы от очистки семян подсолнечника и кукурузная мезга. На этих средах наблюдался обильный рост мицелия, массовое образование плодовых тел и максимальный титр готового биопрепарата 3,0-8,0 × 109 КОЕ/г.

Также высокие показатели роста отмечены при выращивании гриба на средах из соломы, сена и комбикорма 2,0-3,6 × 109 КОЕ/г. Слабый рост гриба или полное отсутствие роста отмечено на средах из сенажа, жома, опилок, отходов от очистки семян горчицы 0-6,0 × 106 КОЕ/г.

Стационарное выращивание штамма Хk-1 -4 Chaetomium olivaceum на искусственных питательных средах

Стационарное выращивание штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum проводили на жидких питательных средах сложного состава – Тайлона-3, Рудакова и Чапека, содержащих углеводы и в разном соотношении соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы. Среды Тайлона-3 и Рудакова в отличие от Чапека содержат кукурузный экстракт (табл. 2).

Таблица 2

Влияние питательных сред и срока стационарного культивирования на рост штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum

Краснодар, ВНИИМК

Питательная среда	Рост мицелия, балл * через, суток			Масса сухого мицелия, г ** через 10 суток
	3	5	10
Чапека	0	1	1	0,27 ± 0,01
Тайлона-3	1	1	3	0,64 ± 0,08
Рудакова	1	2	3	1,26 ± 0,12

* рост мицелия в баллах:

0 – нет роста;

1 – рост мицелия отдельными колониями;

2 – мицелиальная плёнка сплошная тонкая;

3 – мицелиальная плёнка сплошная толстая.

** масса мицелия в расчете на 100 мл питательной среды

Установлено, что максимальный рост мицелиальной плёнки гриба обеспечивает среда Рудакова. Уже через 5 суток культивирования на этой среде отмечена сплошная тонкая мицелиальная плёнка, тогда как на среде Тайло-на-3 гриб рос отдельными поверхностными колониями, а на среде Чапека отдельными колониями в глубине питательной среды. Через 10 суток культивирования на среде Рудакова и на среде Тайлона-3 образовались сплошные толстые мицелиальные плёнки, а на среде Чапека отдельные колонии так и не срослись в одну мицелиальную плёнку. Масса сухого мицелия через 10 суток культивирования была максимальной на среде Рудакова. Следует отметить, что штамм Хk-1-4 Chaeto-mium olivaceum на жидких питательных средах растёт гораздо хуже, чем на естественных субстратах и за 10 суток стационарного культивирования ни на одной из испытанных сред плодовые тела не образовались.

Глубинное культивирование штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum

Изучение кинетики рост гриба при глубинном культивировании показало, что через 24 часа на всех средах отмечен бесцветный, средний по толщине, с выростами, несептированный мицелий с негранулированной цитоплазмой (табл. 3).

При этом мицелий группировался в комочки с диаметром 1,0-4,0 мм на среде Рудакова и 1,0-2,0 мм на среде Тайлона-3. На среде Чапека было много непроросших посевных сумкоспор, а на средах Тайлона-3 и Рудакова их было значительно меньше. рН среды на Чапека 6,5, на Тайлона-3 – 5,0, на Рудакова – 5,5. Утилизация среды составляла: Чапека – 0 %, Тайлона-3 – 10 %, а Рудакова – 20 %.

Через 48 часов культивирования на всех средах отмечено увеличение количества молодого, бесцветного, утолщённого, несептированного, с негранулированной цитоплазмой, но с ещё большим количеством отростков или выростов мицелия. Во всех средах присутствовали свободные сумкоспоры. Уровень рН среды снизился и составлял на среде Чапека 5,0, на среде Тайлона-3 – 4,5 и на среде Рудакова – 5,0. Утилизация среды составляла: Чапека – 10 %, Тайлона-3 – 40 % и Рудакова – 50 %.

Через 72 часа культивирования на всех средах отмечено наличие толстого сероватого, изросшегося в виде бусинок, наростов, септированного, с гранулированной цитоплазмой и молодого слабосептированного

Таблица 3

Кинетика развития культуры штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum при глубинном культивировании

Краснодар, ВНИИМК

Срок культи-виро-вания, час	Питательная среда	Морфологические изменения культуры и спорообразование	Утилизация среды, %	рН среды	Титр, КОЕ/мл
24	Чапека	Мицелий бесцветный, несептированный, средний по толщине, с выростами, с негра-нулированной цитоплазмой; много непроросших сумкоспор	0	6,5	4,9 ×102
	Тай-лона-3	-//-* Мицелий скручивается в комочки 1,02,0 мм; присутствуют сумкоспоры	10	5,0	1,9 × 102
	Рудакова	-//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0-4,0 мм; присутствуют сумкоспоры	20	5,5	2,5 × 102
48	Чапека	Мицелий бесцветный, несептированный, утолщённый, с большим количеством выростов, с негранули-рованной цитоплазмой; присутствуют свободные сумкоспоры	10	5,0	2,5 × 104
	Тай-лона-3	-//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0-2,0 мм	40	4,5	2,0 × 104
	Рудакова	-//-* Мицелий скручивается в комочки 1,0-4,0 мм	50	5,0	2,9 × 104
72	Чапека	Мицелий сероватый, толстый, изросшийся с бусинками, септированный, с гранулированной цитоплазмой и мицелий молодой, бесцветный, слабосептированный; присутствуют свободные сумкоспоры	10	5,0	5,6 × 106
	Тай-лона-3	-//-* комочки 1,0-2,0 мм	50	4,5	7,3 ×106
	Рудакова	-//-* комочки 1,0-4,0 мм	50	5,0	1,9 × 107
96	Чапека	Мицелий сероватый, толстый, с выростами и бусинками, с гранулированной цитоплазмой и мицелий молодой, средний, септированный, с гранулированной цитоплазмой. Начало лизиса старого мицелия. Свободных сумкоспор мало	10	5,0	6,9 × 106
	Тай-лона-3	-//-* комочки 1,0-2,0 мм	50	4,5	8,5 × 106
	Рудакова	-//-* комочки 2,0-3,0-4,0 мм	60	4,5	2,3 × 107

* описание мицелия соответствует таковому на среде Чапека мицелия. Во всех средах присутствовали в незначительном количестве свободные сумкоспоры. рН среды оставался на том же уровне. Утилизация среды составляла: Чапека – 10 %, Тайлона-3 и Рудакова – 50 %. Титр составлял: на среде Чапека – 5,6 × 106 КОЕ/мл, на Тайлона-3 – 7,3 × 106 КОЕ /мл и на Рудакова – 1,9 × 107 КОЕ/мл.

Через 96 часов культивирования на всех средах отмечено наличие толстого, сероватого, с многочисленными выростами и бусинками мицелия и молодого, среднего, септированного мицелия с гранулированной цитоплазмой. Отмечено начало лизиса старого мицелия. Свободных сумкоспор во всех средах было мало. Отмечено начало образования плодовых тел. рН снизился на среде Рудакова до 4,5. Утилизация среды составляла: Чапека – 10 %, Тайлона-3 – 50 %, Рудакова – 60 %. Титр на среде Чапека 6,9 × 106 КОЕ/мл, на Тайлона-3 – 8,5 × 106 КОЕ/мл, на Рудакова – 2,3 × 107 КОЕ/мл.

Визуально:

• -    среда Чапека – прозрачная, ярко-жёлтая, мицелия в среде 10 %; комочков (глобул) не было;

• -    среда Тайлона-3 – прозрачная, светлокоричневая, мицелия в среде 50 %, имелись комочки (глобулы) диаметром 1,0-2,0 мм;

• -    среда Рудакова – мутная, коричневая, мицелия в среде 60 %, имелись комочки (глобулы) диаметром 2,0-4,0 мм.

Таким образом, выращивание штамма антагониста в глубинной культуре сопровождалось обильным ростом мицелиальной массы и не вызывало массового образования плодовых тел и спороношения, титр даже на лучшей питательной среде (Рудакова) не превышал 107 КОЕ/мл, тогда как на средах из естественных субстратов он составлял 109 КОЕ/г.

Заключение. Наиболее благоприятными естественными субстратами для штамма продуцента микробиопрепарата Хk-1-4 Chaetomium olivaceum являлись среды на основе семянок и лузги подсолнечника с различными добавками, отходы от очистки семян подсолнечника и кукурузная мезга. На этих средах наблюдался обильный рост мицелия, массовое образование плодовых тел и максимальный титр готового биопрепарата – 3,0-8,0 × 10⁹ КОЕ/г.

При стационарном культивировании штамма Хk-1-4 Chaetomium olivaceum на жидких питательных средах сложного состава максимальный рост мицелиальной плёнки гриба обеспечивала среда Рудакова. На жидких питательных средах штамм-продуцент

ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.2 (148-149), 2011

рос гораздо хуже, чем на естественных субстратах, и за десять суток культивирования ни на одной из испытанных сред плодовые тела не образовались.

Выращивание штамма при глубинном культивировании сопровождалось обильным ростом мицелиальной массы и не вызывало массового образования плодовых тел и споро-ношения. Титр даже на лучшей питательной среде (Рудакова) не превышал 107 КОЕ/мл, тогда как на средах из естественных субстратов он составлял 109 КОЕ/г.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 11-08-96512-р юг ц.