Оптимальный режим оттаивания криоконсервированной спермы голштинских быков-производителей

За более чем 70-летнюю историю применения криоконсервации для сохранения мужских половых клеток метод получил широкое применение — как в исследовательских программах по сохранению биоразнообразия видов (1), так и в коммерческих целях при создании банков спермы различных видов животных (2) и человека (3). Столь длительная история вопроса позволяет обсуждать не только достижения, но и риски искусственного осеменения (4, 5). Есть мнение, что повышение молочной продуктивности негативно влияет на воспроизводство, в частности отмечается снижение числа отелов от первого осеменения (6). Основной причиной считают несоответствие энергетических затрат потребляемой энергии (7). Как следствие, растет число животных с неполноценными половыми циклами и тихими проявлениями охоты, что усложняет определение времени осеменения. В связи с этим возникает потребность в семени с высокими качественными и количественными характеристиками, способном дли- тельное время (более 24 ч) находиться в половых путях самки без потери оплодотворяющей способности. В то же время при искусственном осеменении после разбавления нативного семени, его расфасовки, криоконсервации и оттаивании число сперматозоидов в спермодозе снижается, что также значительно повышает требования к их качеству.

Основные структурные повреждения сперматозоидов быков и жеребцов связаны с процедурой замораживания и последующего оттаивания (8-10) и спровоцированы фазовым переходом воды в лед и обратно (11, 12). Решающее значение для сохранения целостности мембран и оплодотворяющей способности сперматозоидов имеет температурно-скоростной режим оттаивания (13, 14). Известно, что образование внутриклеточного льда, повреждающего клетку, включает формирование центров кристаллизации и рост кристаллов. При постепенном и медленном охлаждении число центров кристаллизации невелико, но создаются благоприятные условия для их роста. Увеличивая скорость охлаждения, можно миновать оптимум температуры роста кристаллов без повреждения клеток. Размораживание требует максимально быстрого повышения температуры для предотвращения вторичного роста кристаллов льда внутри клеток. Особенно уязвимая точка в процессе оттаивания — значительная рекристаллизация льда (особенно внутри клеток) при - 40 ° С. Формирование центров образования льда внутри клетки может привести к тому, что кристаллы льда будут расти во время оттаивания (15). Чтобы предотвратить вторичную рекристаллизацию, необходимо как можно быстрее провести оттаиваемый объект через зону вторичного роста кристаллов льда. Увеличение скорости оттаивания повышает число жизнеспособных клеток (16).

Самый простой и эффективный метод размораживания криокон-сервированной спермы — на водяной бане (при 37-40 ° С по разным протоколам) с помешиванием для предотвращения локальных температурных градиентов в воде. Чем выше температура водяной бани, тем короче пауза в подъеме температуры в оттаиваемом объекте после прохождения -20 ° С (17). Быстрый отогрев может повышать выживаемость криоконсервиро-ванных клеток благодаря сокращению времени прохождения зоны вторичного роста кристаллов льда и/или процессам, связанными с реорганизацией мембраны. В экспериментах Ф.И. Осташко (17) в облицованных спермодозах после оттаивания в проточной кипящей воде спрематозоиды имели подвижность и оплодотворяющую способность соответственно на 7 и 15 % выше, чем при оттаивании традиционным способом.

Структурно-метаболические нарушения в спермиях при замораживании и оттаивании сопровождаются повреждениями проксимальной центриоли, митохондрий и фибрилл. Наиболее выраженные изменения ультраструктуры спермиев выявлены в акросомах и митохондриях, незначительные структурно-метаболические изменения активности гиалуронидазы, акрозина, аспартатаминотрансферазы и дыхания происходят при температурах около 4-6 ° С (18, 19).

В рутинной практике племенных предприятий использование сложных тестов, основанных на определении ультраструктурных повреждений сперматозоидов, затруднительно (20-24). Для этого предложены технологии автоматизированной дифференциации сперматозоидов по функциональному состоянию, в частности комплексный компьютерный анализ спермы с применением экспонированной микросъемки движущихся сперматозоидов (CASA) (25). Хорошо зарекомендовал себя метод, позволяющий измерять концентрацию, суммарную подвижность, количество активно по-1220

движных (фертильных) сперматозоидов и среднюю скорость их движения на основе лазерного анализа частотного спектра флуктуаций оптической плотности образца сперматозоидов при движении через оптический канал (26). Этот метод адаптирован для практических целей на российских племенных предприятий (8, 27).

До сих пор нет единого мнения о воздействии температуры водяной бани и времени оттаивания на сохранность функциональных характеристик деконсервированных сперматозоидов. Проблеме посвящено много публикаций (28-30), но в большинстве сведения об оптимальных условиях оттаивания спермодоз достаточно противоречивы, а указанные температуры варьируются от 20 до 75 ° С (28, 31-33). В России в соответствии с национальной технологией общепринятой считается методика оттаивания в водяной бане при 38 ° С в течение 10 с. В представленной работе мы впервые сопоставили разные режимы оттаивания семени с фиксацией конечной температуры и на этом основании выбрали оптимальный, позволяющий сохранить пролонгированную жизнеспособность оттаянных сперматозоидов в течение 24-часовой инкубации при 38 ° С.

Целью настоящей работы было сравнение существующих и предложенных авторами режимов деконсервации спермодоз, криоконсервиро-ванных в полипропиленовых соломинках и необлицованных гранулах, и динамики их качественных характеристик (подвижность, скорость движения, переживаемость) при последующей инкубации in vitro при 38 ° С.

Методика. Сперму, полученную от быков-производителей голштинской породы в возрасте 3-7 лет, подвергали крионсервации в полипропиленовых соломинках (72 дозы) на оборудовании фирмы «IMV», модель IS4 (Франция) и необлицованных гранулах (90 доз) на пластинах сухого льда согласно ГОСТ 26030-2015 и Национальной технологии замораживания и использования спермы племенных быков-производителей.

При оттаивании у извлеченных из водяной бани соломинок обрезали запаянный кончик, измеряли температуру внутреннего содержимого с помощью термопары Center 304 («Center Technology Corp.», Тайвань), нажимая поршнем на полипропиленовую пробку, выдавливали оттаянную спермодозу (0,23 мл) в пенициллиновый флакон с 0,8 мл разбавителя opti-Хсе11 («IMV», Франция), прогретого до температуры 30 ° С. Использовали режимы оттаивания: 35 ° С, 30 с; 38 ° С, 10 с (контроль); 50 ° С, 5 с; 70 ° С, 3 с (по 18 спермодоз в каждом варианте). При оттаивании семени, замороженного в необлицованных гранулах, их быстро по одной извлекали из тубы стерильным, предварительно охлажденным в жидком азоте пинцетом и погружали в пенициллиновые флаконы с 0,8 мл разбавителя optiXсell либо с 2,9 % цитрата натрия. При сухом оттаивании гранулы переносили в чистые сухие флаконы.

Сразу после оттаивания и далее через 5, 20 и 24 ч после инкубации in vitro при 38 °С учитывали подвижность (%) визуально под микроскопом (CX41, «Olympus», Япония; увеличение ½150). В этих же образцах на спер-моанализаторе SFA-500 (НПО «Биола», Россия) с использованием лазерного анализатора частотного спектра флуктуаций оптической плотности, вызванных движением сперматозоидов через оптический канал со специальными характеристиками, измеряли подвижность (%), пул быстрых сперматозоидов (%) и среднюю скорость движения сперматозоидов (мкм/с). При помощи термопары Center 304 («Center Technology Corp.», Тайвань) контролировали температуру таяния семени в динамике. Рассчитывали процент подвижных и быстроподвижных сперматозоидов, а также скорость движения и число сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением (ППД) на разных сроках инкубации.

Данные обрабатывали методами вариационной статистики, в таблицах приведены средние ( M ) для каждой серии эксперимента и стандартные ошибки средних (±SEM). Достоверность различий определяли с применением t -критерия Стьюдента. Статистически достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты. Оттаивание семени в необлицованных гранулах проводили при разных режимах (табл. 1).

1. Режимы оттаивания необлицованных гранул с криоконсервированной спермой голштинских быков

Буфер-разбавитель

Температура буфера- разбавителя, °С

Время, с

В водяной бане (40 ° С)

Разбавитель optiXсell (Франция)	38	10
Цитрат натрия (2,9 %)	38	10
Сухое оттаивание		До полного оттаивания
Цитрат натрия (2,9 %)	4	12-13
Разбавитель optiXсell (Франция)	4	12-13
При	комнатной температуре (23 ° С)
Разбавитель optiXсell (Франция)	23	До полного оттаивания
Цитрат натрия 2,9 %	23	До полного оттаивания
Сухое оттаивание	В холодильнике (4 ° С)	До полного оттаивания
Сухое оттаивание		До полного оттаивания

Соломинки с семенем одной серии одновременно оттаивали в водяных банях в указанных режимах, измеряя температуру внутри соломинок сразу после оттаивания. По вариантам температура семени составила 26,0; 25,3; 26,0; 24,3 ° С (в среднем для всех режимов 25,0±0,4 ° С, различия статистически недостоверна). Следовательно, независимо от режима деконсервации конечная температура оттаянных спермодоз была практически одинаковой.

Сравниваемые режимы оттаивания не оказали существенного достоверного влияния на количество сперматозоидов с ППД (колебания в пределах 35-38 %), что подтвердилось и при исследовании образцов на анализаторе SFA-500 (34,4-36,5 % клеток, различия недостоверны) (табл. 2). Это согласуется с данными других авторов, полученных на семени буйвола (28, 31), крупного рогатого скота (29), зебу (31). Аналогичные результаты мы получили для быстроподвижных сперматозоидов (различия недостоверны при вариациях от 23,8 до 24,2 %). Наибольшую скорость движения сперматозоидов отмечали в образцах, размороженных при 35 ° С, и она снижалась при деконсервации с ростом температуры водяной бани (при максимальной температуре наблюдали достоверные различия, р < 0,001). При оттаивании криоконсервированной спермы буйволов скорость была максимальной в образцах, оттаянных при + 70 ° С (28).

2. Подвижность и доля (%) подвижных спермиев в семени голштинских быков, оцененная двумя методами сразу после оттаивания 72 доз при разных режимах (ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Московская обл., 2018 год)

Температура оттаивания, °С	Микроскопия	Анализатор SFA-500
	доля подвижных, %	доля подвижных, %	средняя скорость, мкм/с
		медленные + быстрые    быстрые

	0 ч	инкубации in vitro, 38 ° С
35	35,0±0,90	34,4±0,09*	23,9±0,30	100,7±1,2
38 (контроль)	38,3±0,53	35,1±0,30	23,7±0,20	97,8±1,03
50	36,6±0,53*	36,5±0,76	24,2±0,40	96,3±0,6

	Продолжение таблицы 2
70	35,0±0,90** 5 ч	34,4±0,70 инкубации in vitro, 38 ° С	23,8±0,30	91,3±0,16***
35	30,0±0,90	38,4±0,70	27,8±0,20*	97,8±2,30
38 (контроль)	30,0±0,93	37,8±0,13	28,7±0,40	102,8±1,70
50	30,0±0,93	34,5±0,66***	26,2±0,20***	102,0±1,70
70	28,3±1,40 20 ч	38,9±0,20*** инкубации in vitro, 38 ° С	27,3±0,20**	96,6±1,36**
35	20,0±0,00***	24,0±0,5**	15,1±0,30***	81,6±0,30
38 (контроль)	23,3±0,53	26,3±0,56	16,7±0,05	81,6±1,30
50	20,0±0,09***	19,8±0,26***	12,8±0,33***	76,9±1,50*
70	18,3±0,50*** 24 ч	19,8±0,60*** инкубации in vitro, 38 ° С	12,5±0,43***	79,1±0,30
35	10,0±1,70***	11,4±1,60***	5,8±0,80***	71,0±0,30***
38 (контроль)	15,0±0,00	18,4±0,4	11,4±0,46	79,3±1,36
50	8,3±0,53***	10,7±0,7***	4,9±0,6***	62,7±2,70***
70	5,6±0,70***	8,2±0,93***	4,1±0,43***	73,1±0,86***
*, **, *** Различия с контролем статистически значимы соответственно при р < 0,05, р < 0,01 и р < 0,001.

После 5 ч инкубации образцов in vitro (см. табл. 2) отмечалось несовпадение результатов оценки подвижности: визуально ее сохраняли 28,3-30,0 % сперматозоидов, тогда как компьютерный анализ выявил на 410 % больше подвижных половых клеток. Кроме того, спермоанализатор зафиксировал увеличение моторики сперматозоидов по сравнению с состоянием сразу после оттаивания. Аналогичные данные были получены после 2-часовой инкубации (29). Достоверно наибольшее количество таких клеток (38,9 %) наблюдали при быстрой деконсервации (70 ° С), достоверно наименьшее — при температуре размораживания 50 ° С.

Отметим, что доля быстроподвижных (фертильных) спермиев (28,7 % при средней скорости 102,8 мкм/с) оказалась достоверно выше при стандартной технологии оттаивания. Различия между контрольной и опытными группами во всех случаях были статистически значимыми. Вероятно, визуально фиксируются преимущественно сперматозоиды с ППД, тогда как спермоанализатор учитывает все сперматозоиды, движущиеся по разным траекториям со скоростью свыше 25 мкм/с. Этот минимальный порог скорости установлен для отсечения клеток, не имеющих собственной подвижности и перемещающихся с током жидкости (8). Спустя 20 ч инкубации (см. табл. 2) число сперматозоидов с ППД сократилось в среднем на 10 %, средняя скорость — на 20 % по сравнению показателями после 5 ч инкубации. Отметим, что в спермодозах, деконсервированных по стандартной методике, сохранилось больше клеток с ППД. Эта тенденция прослеживалась как при рутинной микроскопии, так и при автоматическом исследовании (наблюдаемые различия статистически значимы). Через 1 сут после оттаивания и инкубации in vitro при 38 ° С (см. табл. 2) лучшую сохранность (доля подвижных сперматозоидов 18,1 %) также проявили образцы семени, деконсервированные в водяной бане при 38 ° С по стандартной методике (разница с образцами при других режимах — от 6,7 до 10,0 %; различия статистически значимы при р < 0,001).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что отступления от общепринятой методики оттаивания семени снижают его качественные характеристики и оплодотворяющую способность. Это подчеркивает необходимость строжайшего соблюдения установленных регламентов. В ряде публикаций также сообщается, что лучшие результаты дает оттаивание спермо-доз в диапазоне температур от 37 до 40 °С (30, 31). Четкое соблюдение методики оттаивания спермы может повысить результативность искусственного осеменения, особенно при поздней овуляции (более 24 ч после выявленной охоты; число таких животных среди высокопродуктивных особей составляет более 50 %) (27).

Суточная динамика активности клеток, выраженная в абсолютных величинах (рис.), показывает, что сразу после оттаивания число подвижных спермиев в среднем составляло 33-35 млн, и около трети из них — это сперматозоиды с ППД (при подсчете не учитывали спермии со скоростью движения ниже 25 мкм/с). После 5 ч инкубации во всех группах число спермиев с ППД возрастало на 8-12 % (исключение — спермодозы, размороженные при 50 °С). Возможно, наблюдаемое увеличение связано с начинающимися процессами гиперактивации.

Число спермиев (½10⁶ кл. на спермодозу) с прямолинейно-поступательным движением у голштинских быков в зависимости от температурного режима размораживания спермодоз и разных сроков их последующей инкубации : 1 — 5 ч, 2 — 20 ч, 3 — 24 ч, 4 — без инкубации (ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Московская обл., 2018 год)

Известно, что процесс замораживания-оттаивания служит пусковым механизмом самопроизвольной капацитации. Считают, что процесс капацитации сперматозоидов термозависим, а блокирующий эффект преодолевается при возвращении спермиев к температуре 37 °С (32). Ключевым фактором здесь выступает частичное криоповреждение мембран клеток, в частности в районе акросомального чехлика, вследствие чего изменяется внутриклеточная концентрация кальция (34). Несмотря на то, что у крупного рогатого скота подвижность сперматозоидов коррелирует с оплодотворяющей способностью и может успешно использоваться для ее экспресс-тестирования, в практической работе все же следует контролировать продолжительность жизни половых клеток вне организма.

С увеличением срока инкубации (до 20 и 24 ч) наибольшее число сперматозоидов с ППД (соответственно 8,3 и 5,7 млн) сохранялась в образцах, дефростированных в водяной бане при 38 °С в течение 10 с. Через 24 ч в образцах, размороженных в водяной бане при других температурах, число клеток с ППД было на 2-3 млн меньше (см. рис.). Это следует учи- тывать при осеменении, так как в половых путях самки сперма накапливается в специальном резервуаре яйцевода, прикрепляясь к его стенкам не теряя своей оплодотворяющей способности в течение суток при условии сохранения своей функциональной полноценности (33).

В экспериментах с необлицованными гранулами мы изменили стандартные условия деконсервации. Согласно утвержденному в России протоколу, дозу семени следует поместить во флакон с 1 мл 2,9 % цитрата натрия, предварительно прогретого до 38 °С и размораживать при 40 °С в течение 8-10 с до тонкого ледяного стерженька. Мы выполняли размораживание вне водяной бани при комнатной температуре 23 °С, а также использовали водяную баню при 40 °С, но предварительно охлажденный до 4 °С цитратный буфер. Оптимальные результаты получили при оттаивании гранул с использованием водяной бани (табл. 3). Более того, начальные показатели семени были несколько выше во всех вариантах с охла- жденным цитратом. Однако после 5 ч инкубации активных сперматозоидов оказалось на 11,6 % больше при размораживании в цитратном буфере, прогретом до 38 °С.

Конечная температура оттаивания, определенная с помощью термопары, в суспензии половых клеток при размораживании в водяной бане в обоих случаях была одинаковой и в среднем оставила примерно 28 ° С с незначительным увеличением по времени оттаивания при использования охлажденного буфера. Размораживание гранул в цитратном буфере при комнатной температуре (23 ° С) показало, что время оттаивания возрастает, конечная температура суспензии достоверно (р < 0,05) снижается до 13,9 ° С, а сохранность сперматозоидов значительно ухудшается по сравнению с показателями, которые отмечали при использовании водяной бани (40 ° С). В конечном итоге это снизит результативность искусственного осеменения.

28,6±0,80

18,3±0,60**

29,3±1,30

3. Качественные характеристики семени голштинских быков, криоконсерви-рованного в необлицованных гранулах, после размораживания в водяной бане с разными разбавителями и инкубации (0 ч и 5 ч) (ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Московская обл., 2018 год)

Микроскопия	Анализатор SFA-500		Время оттаивания, с	Температура спермодозы, °С
доля подвижных, %	доля подвижных, %	средняя скорость, мкм/с
0 ч       5 ч	медленные + быстрые быстрые
Ц ит р ат нат р ия (2,9 %)

Контроль (1 мл разбавителя, t = 38 ° С, t размораживания 40 ° С) 36,6±1,60  28,3±1,60         36,0±2,30         21,6±0,90    84,3±2,30     10,0±0,00

I группа (1 мл разбавителя, t = 23 ° С, без водяной бани) 33,3±3,30  16,6±4,40^*         29,3±1,00^*        18,8±1,20    96,6±4,90^*    23,3±2,00^***

II группа (1 мл разбавителя, t = 4 ° С, t размораживания 40 ° С) 41,6±1,60^* 25,0±2,80         47,3±2,80^*        23,1±2,50    73,2±9,90     13,6±1,20

С и н т е т и ч е с к и й р а з б а в и т е л ь optiXсell (Франция)

Контроль (1 мл разбавителя, t = 38 ° С, t размораживания 40 ° С)

31,6±4,40 30,0±5,00         40,5±3,50         23,6±3,10    84,3±6,50     11,3±1,30

III группа (1 мл разбавителя, t = 23 ° С, без водяной бани) 35,1±0,10  30,0±2,80         48,8±8,10         28,2±2,30    86,8±5,00     14,6±0,60^*

IV группа (1 мл разбавителя, t = 4 ° С, t размораживания 40 ° С) 36,6±1,60  26,6±3,30         38,0±1,50         22,0±0,20    83,9±3,20     12,0±1,00

28,5±4,20

13,9±4,50*

28,3±0,30

*, **, *** Различия с контролем статистически значимы соответственно при р < 0,05, р < 0,01 и р < 0,001.

В настоящее время в России на племенных предприятиях преимущественно применяют импортируемые синтетические разбавители спермы. В нашем опыте при замене цитратного буфера синтетической средой optiXсell размораживание необлицованных гранул дало неоднозначные результаты, которые требуют дальнейшего изучения (см. табл. 3). Как и в варианте с цитратным буфером, сразу после деконсервации с использованием водяной бани (40 °С) подвижность сперматозоидов была выше в разбавителе, охлажденном до 4 °С, но после 5-часовой инкубации активных сперматозоидов оказалось на 11,3 % больше в случае изначально теплого (38 °С) разбавителя. При этом конечная температура полученной суспензии половых клеток и время оттаивания спермодозы не отличались от таковых для цитратного буфера. Несколько иные закономерности проявились при деконсервации необлицованных гранул в синтетическом разбавителе при комнатной температуре: процесс оттаивания по времени сократился на 8,7 с, а конечная температура образцов повысилась 4,4 °С по сравнению с показателями для цитратного буфера. Подвижность и сохранность сперматозоидов в группе, где спремодозы размораживали при комнатной температуре с синтетическим разбавителем optiXсell, имели тенденцию к улучшению (без подтверждения статистически значимых раз- личий). Полученные данные указывают на необходимость изучения механизмов действия этого синтетического разбавителя при заморажива-нии/оттаивании спермы. Предполагается, что белки семенной плазмы связываются с фракцией низкой плотности яичного желтка, входящего в состав среды, что имеет решающее значение в сохранении клеточной мембраны сперматозоидов (35, 36).

В нашем опыте при сухом оттаивании (без разбавителя) проявилась прямо пропорциональная зависимость между подвижностью сперматозоидов и температурой окружающей среды (табл. 4). Так, лучшие результаты получили при 40 ° С (контроль): 45 % сперматозоидов имели ППД сразу после оттаивания и 30 % сохраняли жизнеспособность после 5 ч инкубации при 38 ° С. С увеличением времени оттаивания и снижением температуры окружающей среды доля жизнеспособных сперматозоидов сокращалось: при комнатной температуре спустя 5 ч выживаемость составила 21 % по сравнению с 66 % в первом варианте. При медленной деконсервации (4 ° С) время оттаивания резко возросло (до 820 с), что губительно сказалось на жизнеспособности сперматозоидов: непосредственно после оттаивания ППД сохраняли только 6,7 % спермиев, спустя 5 ч — лишь единичные клетки.

4. Качественные характеристики семени голштинских быков, криоконсервиро-ванного в необлицованных гранулах, после сухого оттаивания (без разбавителя) и инкубации (0 ч и 5 ч) (ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Московская обл., 2018 год)

Режим оттаивания

Доля подвижных, % 0 ч        5 ч

Время оттаивания, с

Температура спермодозы, °С

На водяной бане при 40 ° С (контроль) 45,0±2,80  30,0±0,00

При комнатной температуре 23 ° С     23,3±6,00 ** 5,0±0,00 ***

В холодильнике при 4 ° С 6,7±1,60 *** 1,7±1,60 ***

56,0±3,05 222,3±76,00* 820,0±40,00***

27,7±8,20

12,2±5,14

15,2±1,80

*, **, *** Различия с контролем статистически значимы соответственно при р < 0,05, р < 0,01 и р < 0,001.

В таблице 4 отсутствуют данные, полученные с помощью анализатора SFA-500: в характеристиках прибора указаны пределы концентрации сперматозоидов (5-100 млн/мл) для качественного и количественного анализа образца с допустимой погрешностью, вне этих значений погрешность резко возрастает. В нашем опыте при сухом оттаивании концентрация в объеме спермодозы возрастала до 160-190 млн/мл, что сделало интерпретацию полученных результатов невозможной (дополнительное применение сред и буферов для разбавления семени привело бы к искажению первоначального эффекта).

Таким образом, технологии деконсервации спермодоз, расфасованных в соломинки и необлицованные гранулы, нашли широкое практическое применение во всем мире и постоянно усовершенствуются. В нашем опыте наилучшие результаты с бычьей спермой дало размораживание в течение 10 с в водяной бане при 38 °С для соломинок и 40 °С — для не-облицованных гранул. Эти протоколы достоверно обеспечивают пролонгированное положительное влияние на качественные характеристики сперматозоидов и лучшее сохранение их жизнеспособности после оттаивания, чем другие способы (p < 0,001). Полученные нами результаты также показали, что одна из современных модификаций этих процедур, а именно использование синтетических безжелтковых разбавителей, требует углубленного изучения влияния таких сред на качественные характеристики сперматозоидов у животных разных видов и уточнения на этой основе существующих технологических регламентов деконсервации. Наши данные подтверждают известный факт, что даже небольшие отклонения условий от оптимальных при проведении описанных процедур могут значительно ухудшить свойства спермиев и в итоге снизить результативность искусственного осеменения. При этом в ряде случаев наблюдаемые эффекты неоднозначны, что указывает на возможный сложный механизм воздействия применяемых агентов на характеристики спермиев и, как следствие, на результаты искусственного осеменения.