Оптимизация процесса культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae с целью повышения выхода алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы

Совершенствование традиционных и разработка новых способов культивирования микроорганизмов являются основой для получения продуктов биосинтеза и использования специфических микробных процессов в отдельных областях биотехнологии [1, 2]. Постоянное внимание уделяется поиску средств, позволяющих поддерживать необходимые ростовые и биосинтетические характеристики микробных продуцентов на протяжении определенной ферментационной стадии или всего жизненного цикла [3-5].

Среди отходов пищевой промышленности значительное место занимает молочная сыворотка, получаемая при переработке молока на сыр, творог или казеин. Молочная сыворотка является хорошей средой для выращивания дрожжей [6, 7].

Целью данной работы является оптимизация процесса культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae с целью повышения выхода алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы.

В качестве объекта исследований были выбраны дрожжи S. сerevisiae , обладающие высокой каталитической активностью по отношению к этиловому спирту и ацетальдегиду и являющиеся перспективным сырьем для получения алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогеназы (АЛДГ) [8, 9].

Для выращивания дрожжей S. сerevisiae применяли молочную сыворотку, полученную при производстве творога. Сыворотку стерилизовали и перед использованием в эксперименте центрифугировали для удаления осадка. Сухие вещества в сыворотке определяли по сахарометру. Поскольку молочная сыворотка характеризуется низким содержанием азотистых соединений, фосфора и глюкозы, в качестве дополнительных источников азота вносили 250 мг/л (NH 4 ) 2 SO 4 , магния - 200 мг/л MgSO 4 , а также 5,0 г/л глюкозы.

Выращивание дрожжей осуществляли в лабораторных дрожжерастительных аппаратах, снабженных мешалкой с рабочим объемом 5 л. Для экспериментов использовали посевной материал, выращенный на качалке в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды. Величину посева среды в аппарате определяли взвешиванием высушенных до постоянной массы дрожжей, отцентрифугированных из 10 мл культуральной жидкости. В аппарат смывали отцентрифугированные дрожжи из двух колб. Условия выращивания были следующими: температура 32-34ºС, рН среды 4,5-5,5, аэрация воздухом – 100 л/мин при скорости вращения мешалки 1000 об/мин.

Время окончания роста дрожжей первоначально определяли по прекращению накопления биомассы.

Биомассу дрожжей определяли как разницу биомассы до и после культивирования.

Для количественной характеристики культивирования дрожжей S. cerevisiae пользовались показателем удельной скорости роста, которая характеризует часовой прирост на единицу растущей биомассы.

Анализ динамики роста дрожжей проводили путем отбора из аппарата через заданные промежутки времени 20 мл культуральной среды и центрифугированием ее с последующим установлением количества дрожжей весовым методом.

Массовую долю жира в дрожжах определяли кислотным методом Гербера по ГОСТ 5867.

Для определения содержания белка использовали анализатор общего азота (белка) «Rapid N cube» и метод Дюма.

Наличие ферментов алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в дрожжах и культуральной жидкости определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).

Каталитическую активность алкогольдегидрогеназы оценивали по скорости окисления кофермента никотинамиддинуклеотида восстановленного (НАДН), которую регистрировали на самописце спектрофотометра по убыли величины оптической плотности при длине волны 340 нм.

Каталитическую активность альдегиддегидрогеназы определяли методом Б.М. Кершенгольц и Е.В. Серкиной [10], регистрируя начальную скорость образования НАДН при окислении ацетальдегида с образованием уксусной кислоты.

Выращивание дрожжей S. сerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники азота, фосфора и глюкозы, сопровождалось интенсивным нарастанием биомассы. Результаты, полученные при выбранных параметрах, представлены в таблице 1. Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что удельная скорость роста дрожжей возросла в 1,2 раза при выращивании на молочной сыворотке с дополнительным источником азота, 1,5 раза при выращивании с дополнительным источником фосфора и в 1,7 раз при выращивании с дополнительным источником глюкозы по сравнению с контролем. В качестве контроля использовали молочную сыворотку. При этом выход биомассы увеличился в 1,17; 1,85 и 2,1 раза при использовании дополнительного источника азота, фосфора и глюкозы, соответственно. Из таблицы 1 также следует, что повышения активности АДГ и АЛДГ в результате внесения дополнительных источников азота, фосфора и глюкозы не наблюдалось. Из представленных данных можно сделать вывод о том, что оптимальной средой для выращивания дрожжей S. сerevisiae является молочная сыворотка, содержащая дополнительное количество глюкозы.

Таблица 1 Характеристика процесса культивирования дрожжей штамма S. Cerevisiae

Характеристика	Контроль	Наименование элементов
		(NH 4 ) 2 SO 4	MgSO 4	Глюкоза
Удельная скорость роста, ч 1	0,010±0,0007	0,012±0,0008	0,015±0,0009	0,017±0,0009
Выход биомассы, г/г	0,60±0,03	0,70±0,04	1,11±0,05	1,25±0,07
Накопление биомассы дрожжей, г/л	19,80±1,20	24,10±1,45	30,70±1,54	36,50±2,20
Удельная активность АДГ, Е/мг белка	20,00±1,20	20,00±1,20	20,00±1,20	20,00±1,20
Удельная активность АЛДГ, Е/мг белка	0,30±0,02	0,30±0,02	0,30±0,02	0,30±0,02
Состав биомассы дрожжей, % массовая доля белка массовая доля жира	42,00±2,50 11,60±0,70	50,80±3,05 9,50±0,60	75,30±4,50 3,40±0,25	75,30±4,50 3,40±0,25

Изучение кинетики рассматриваемых явлений (рис. 1) показало, что после введения в среду активатора следует стадия задержки роста дрожжей. Так, для культур, активируемых источником азота, рост начинается через 4,5 ч после внесения активатора. Культуры, активируемые источником магния и глю- козой, имеют сходный по продолжительности период задержки роста. Во всех опытах длительность этого периода составляет 1,5-2,0 ч. Задержку роста можно объяснить перестройкой биохимических систем клетки при переходе от низкой скорости роста биомассы к максимальной, связанной с синтезом дополнительных ферментов и других компонентов клетки.

Рис. 1. Кривые роста дрожжей S. сerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники: 1 – азота, 2 – магния, 3 – глюкозы

Таким образом, популяция дрожжей в течение 4,5 ч способна увеличить скорость размножения до максимального уровня, что свидетельствует о высоких адаптивных возможностях дрожжей рода S. сerevisiae .

Для всех опытов по активации роста любым из трех источников питания характерно скачкообразное увеличение скорости роста после стадии задержки. При этом в первые 1,0-2,5 ч после начала роста его скорость близка к максимальному значению. Изучение динамики изменения возрастного состава изучаемых популяций показало также наличие стадии задержки. Однако продолжительность этого периода почти не зависит от предыстории культуры и природы фактора активатора. Во всех экспериментах почкование начинается через 2,0-4,5 ч после активации. При этом в первые 6 ч доля ювенильных почек достигает значения 25-40%, в то время как у стационарных культур величина этого показателя не превышает 10%. Для культур, активированных источником азота, максимальные концентрации ювенильных почек отмечаются в период задержки размножения клеток. Высокая концентрация почкующихся клеток свидетельствует об увеличении продолжительности данного периода, то есть увеличении времени, необходимого для прохождения клеткой ранних стадий митоза, профазы и метафазы, в сравнении с нормой.

Дальнейшие исследования направлены на изучение влияния условий культивирования дрожжей рода S. сerevisiae на уровень секреции ферментов АДГ и АЛДГ. Из литературных данных известно, что условия культивирования дрожжей – интенсивность аэрации, время и температура, концентрация основных компонентов среды могут влиять на количественный выход белков и каталитическую активность ферментных систем. Результаты собственных исследований показывают, что максимальный выход биомассы наблюдается при отношении объема культуральной жидкости к объему воздушной среды (Vкж/Vвс), равном 1:4, что свидетельствует о важности процессов дыхания в метаболизме дрожжей. В то же время оказалось, что на стадии индукции синтеза белка оптимальными являются отношения 1:2 (рис. 2).

B следующей серии опытов определяли влияние температуры на процесс культивирования дрожжей и синтез АДГ и АЛДГ. Результаты, полученные в ходе проведения исследований, представлены на рисунке 3.

Результаты, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о значительных колебаниях величины удельной скорости дрожжей в зависимости от температуры. Видно, что при повышении температуры во всех экспериментах наблюдаются длительные периоды, при которых удельная скорость роста значительно превышает ее значение при исходной и конечной температуре, установленной у культуры, растущей при постоянном температурном режиме. Наблюдаемое явление можно объяснить тем, что дрож- жи, находящиеся в различных стадиях развития, по-разному реагируют на изменение температуры, что, в свою очередь, приводит к значительному изменению возрастного состава культуры при температурных переходах.

Рис. 2. Влияние интенсивности аэрации на выход биомассы дрожжей S. сerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники: ■ – азота, – магния, ■ – глюкозы

Рис. 3. Влияние температуры на культивирование дрожжей S. сerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники: ^ - азота, ^е - магния, - глюкозы

Из рисунка 3 также следует, что оптимальной температурой роста дрожжей рода S. сerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники азота, магния либо глюкозы, является температура 30ºС.

На следующем этапе исследования определяли продолжительность культивирования дрожжей, обеспечивающую максимальный выход алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогензы с учетом параметров, выбранных ранее. Результаты представлены в таблице 2. Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что оптимальной продолжительностью культивирования дрожжей S. сerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники азота, магния и глюкозы, является 18 ч, поскольку дальнейшее увеличение продолжительности культивирования не приводит к повышению активности ферментов АДГ и АЛДГ.

Таким образом, проведены исследования, направленные на изучение условий культивирования дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae , обеспечивающих максимальный выход алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогензы. В качестве среды была использована молочная сыворотка, обогащенная дополнительными источниками азотистых соединений, фосфора и глюкозы в количествах: (NH 4 ) 2 SO 4 – 250 мг/л, источников магния MgSO 4 - 200 мг/л и глюкозы – 5,0 г/л. Максимальные величины удельной скорости роста дрожжей и активности АДГ и АЛДГ при использовании всех исследуемых источников питательных веществ наблюдаются при температуре 30ºС, продолжительности культивирования 18 ч и

Активность ферментов АДГ и АЛДГ, продуцируемых дрожжами S. cerevisiae

Таблица 2

Продолжительность Удельная активность ферментов, Е/мг белка культивирования, ч АДГ                              1 АЛДГ Молочная сыворотка, содержащая (NH4)2SO4 2 1,30±0,08 0,04±0,003 4 2,50±0,15 0,04±0,003 8 9,00±0,54 0,09±0,006 12 12,70±0,76 0,13±0,009 16 17,60±1,06 0,21±0,01 18 20,00±1,20 0,30±0,02 20 20,00±1,20 0,30±0,02 Молочная сыворотка, содержащая MgSO4 2 1,05±0,06 0,09±0,005 4 1,90±0,11 0,11±0,007 8 7,85±0,47 0,15±0,009 12 10,40±0,62 0,21±0,01 16 15,70±0,94 0,23±0,01 18 20,00±1,20 0,30±0,02 20 20,00±1,20 0,30±0,02 Молочная сыворотка, содержащая глюкозу 2 1,78±0,11 0,14±0,008 4 2,89±0,17 0,19±0,01 8 10,70±0,64 0,24±0,02 12 14,60±0,88 0,36±0,02 16 18,65±1,12 0,42±0,03 18 20,00±1,20 0,30±0,02 20 20,00±1,20 0,30±0,02 отношении объема культуральной жидкости к объему воздушной среды (Vкж/Vвс), равном 1:4. При этом максимальная удельная скорость роста дрожжей S. cerevisiae, равная 0,017 ч-1, наблюдается при использовании в качестве питательной среды молочной сыворотки, обогащенной глюкозой. Для описанного случая характерны также максимальные величины выхода биомассы (1,25 г/г) и накопления биомассы дрожжей (36,50 г/л). В связи с этим перспективным является использование в качестве питательной среды для выращивания дрожжей S. cerevisiae, являющихся продуцентами алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогензы, молочной сыворотки с дополнительным источником глюкозы.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, гос. контракт №16.740.11.0192 от 24 сентября 2010 г.