Оптимизация состава питательной среды пробиотического штамма B. subtilis Ga24 - продуцента кормовых ферментов

Эффективность отрасли сельского хозяйства, специализирующей на промышленном производстве яиц и мяса птицы, обусловливается многими факторами, основным из которых является полноценное кормление со сбалансированным рационом питания и усвояемость питательных веществ кормов [1, 8]. В рацион сельскохозяйственной птицы преимущественно включают семена зерновых и зернобобовых культур, представляющие собой главные источники питательных соединений и энергии. Тем не менее, они в своем составе содержат антипитательные факторы – некрахмалистые полисахариды, которые способны ухудшать перевариваемость корма, снижать его конверсию, а также негативно воздействовать на кишечную микробиоту, определяющих здоровье и продуктивность птицы, качество получаемой от них продукции [8, 12].

Для противодействия негативным свойствам структурных полисахаридов современные подходы безопасного кормления птицы включают применение биологически активных средств на основе экзогенных ферментов и микроорганизмов, действие которых нацелено на восполнение энзимной активности пищеварительных секретов желудочно-кишечного тракта и нормализацию микробного кишечного баланса животных [12, 14]. Вследствие этого данные биопрепараты следует рассматривать в качестве альтернативы стимуляторам роста и продуктивности (кормовым антибиотикам) сельскохозяйственных животных.

В последнее время наибольший интерес представляют пробиотические штаммы споровых бактерий вида Bacillu s subtilis , которые способны активно секретировать широкий спектр внеклеточных ферментов гидролитического действия (ксиланаз, целлюлаз, амилаз, пектиназ, фитаз, протеаз и липаз) в связи с перспективами создания на их основе энзимно-пробиотических комплексов [5, 6]. Так, способностью продуцировать гидролитические ферменты характеризуется пробиотический штамм B. subtilis 945, составивший основу добавки к корму бацелл [2]. Различные штаммы B. subtilis – продуценты экстрацеллюлярных гидролаз изучаются как основа препаратов, которые направлены на снижение вязкости содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных птиц и ингибирования роста вызывающих некротический энтерит Clostridium perfringens [8].

Эффективность процесса расщепления структурных полисахаридов индивидуальными штаммами микроорганизмов, главным образом, обусловлена уровнем активности образуемых ими гидролазных комплексов [2, 7]. В связи с этим энзимологами постоянно проводятся исследования, ориентированные на поиск наиболее продуктивных микробных штаммов и разработку эффективных стратегий повышения образования ими кормовых ферментов.

Цель исследования – оптимизация состава питательной среды для повышения продукции кормовых ферментов глубинной культуры B. subtilis GA24.

Материал и методы исследований. В работе применяли пробиотический штамм B. subtilis GA24 из коллекции микроорганизмов Всероссийского научноисследовательского института фитопатологии (ФГБНУ ВНИИФ). Культуру бациллярного штамма поддерживали пересевами на мясопептонной агаризованной среде (МПА). Хранение бациллы осуществляли в пробирках со скошенной питательной средой при температуре 4°C, пересев – через 6-8 недель.

Пробиотический штамм B. subtilis GA24 выращивали на жидкой минеральной питательной среде [7, 9]. В качестве индукторов синтеза кормовых ферментов использовались ксиланаза и пептон. Исследуемый продуцент культивировали в конической колбе на качалке (180 об./мин) в аэробных условиях при 36°C в течение 36 ч. Биомассу бациллы отделяли путем центрифугирования (10 тыс. g) в течение 8 мин [10]. Культуральный супернатант применяли для оценки ее на активность ксиланаз и протеаз.

Установление активности ксиланазы пробиотического штамма проводили согласно калориметрическому методу, который основан на определении восстанавливающих углеводов, образующихся при их воздействии на субстрат ксилан [11, 12]. При этом за единицу гидролазной активности принимали определенное количество ферментов, которое в стандартных условиях катализирует процесс расщепления субстрата с образованием 1 мкмоли восстанавливающих сахаров. Активность протеазы устанавливали согласно универсальной методике с применением в качестве субстрата казеина [8]. При этом за 1 единицу активности фермента принимали определенное его количество, катализирующее отщепление 1 мкмоль тирозина в опытных условиях. Гидролазную активность ферментов выражали в Ед./мл.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили стандартным методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Office Excel 2010.

Результат исследований. Согласно современным представлениям, продукция внеклеточных ферментов в условиях глубинного культивирования микроорганизмов представляет собой процесс, регуляция которого обусловлена источниками их питания [9, 12]. При этом химическая природа источников, их соотношение в культуральной среде способны оказывать существенное влияние на уровень и спектр (состав) синтезируемых микроорганизмами экзоферментов. Анализ данных литературы показывает, что лучшими источниками углеродного и азотного питания, которые могут способствовать наибольшей секреции ксиланаз и протеаз штаммами споровых бактерий вида Bacillu s subtilis , служат ксилан и пептон [9, 13]. В связи с этим, нами были проведены исследования влияния различных концентраций вышеуказанных углерод- и азотсодержащего субстратов на синтез кормовых ферментов пробиотического штамма B. subtilis GA24 в условиях его глубинного культивирования.

Результаты исследования показали, что наибольшее повышение активности ксиланаз и протеаз пробиотического штамма B. subtilis GA24 отмечается при внесении в культуральную среду ксилана в концентрации 1,0 % и пептона в концентрации 0,75 % (Таблица 1).

Исследована зависимость динамики накопления кормовых ферментов и микробной биомассы в условиях глубинного культивирования штамма B. subtilis GA24 на среде, содержавшей ксилан 10,0 г/л и пептон 7,5 г/л. Результаты исследования представлены на рисунке 1.

Таблица 1 – Влияние состава культуральной среды на продукцию кормовых ферментов

Рисунок 1 – Динамика накопления ксиланаз (КсЗ) и протеаз (ПрЗ) (слева), микробной

пробиотического штамма B. subtilis GA24

*Различия между вариантами статистически значимы (Р<0,05). Установление активности ферментов проводили на первые сутки культивирования биомассы (справа) в условиях глубинного культивирования штамма B. subtilis GA24 на среде, содержавшей ксилан 10,0 г/л и пептон 7,5 г/л (различия между значениями протеазной активности и роста бациллы на 12-е и 24-е ч культивирования не значимы)

Как видно из рисунка, активная секреция протеаз изучаемым штаммом в культуральную среду происходит в первые 12 часов его роста и к 24 часам выращивания достигает значения гидролазной активности (51,3 ± 1,3) Ед/мл. Ферментативная активность ксиланаз возрастала в первые 24 часа выращивания бациллярного штамма, параллельно с повышением выхода микробной биомассы культуры. При этом ксиланазная активность составила (9,9 ± 0,3) Ед/мл.

Результаты нашего исследования согласуются с данными зарубежных авторов, установившие максимальные значения активности ксиланаз в культуральной жидкости бактерий рода Bacillus в конце экспоненциальной фазы и достаточно высокий уровень активности данного фермента во время стационарной фазы роста культуры [13, 14]. В литературе также имеются сведения, что в условиях глубинного выращивания бацилл активное накопление протеолитических ферментов происходит в конце фазы экспоненциального роста [9].

Заключение. Результаты по оптимизации содержания углерод- и азотсодержащего субстратов в условиях глубинного культивирования пробиотического штамма B. subtilis GA24 показали, что наибольшее повышение активности ксиланаз и протеаз бациллы отмечается при внесении в среду ксилана в концентрации 1,0 % и пептона в концентрации 0,75 % - (9,9±0,3) и (51,3±1,3) Ед/мл, соответственно. Дальнейшее изучение способности данного штамма к продукции кормовых ферментов открывает возможности применения его в биотехнологических исследованиях, а также для создания биопрепарата, объединяющего свойства пробиотика и кормового фермента.

Исследование выполнено при поддержке гранта Президента Российской Федерации № МК-2439.2022.5 («Новые подходы с использованием пробиотиков, метабиотиков и бактериальных ферментов для коррекции вызванных действием патогенных факторов микроэкологических нарушений кишечника молодняка сельскохозяйственной птицы»).

Резюме