Оптимизация условий получения плазмидной ДНК E. coli с фрагментами генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса АЧС

Во всем мире, в том числе и в Республике Татарстан, свиноводство является стратегически значимой отраслью обеспечения глобальной продовольственной безопасности. Тем не менее, эта отрасль экономики особенно уязвима из-за трансграничных инфекционных заболеваний, среди которых в настоящее время наиболее серьезную угрозу представляет африканская чума свиней (АЧС) – летальное геморрагическое заболевание домашних свиней и кабанов, вызываемое сложным оболочечным дезоксивирусом семейства Asfarviridae [2, 8, 10]. Профилактика и борьба с АЧС осложнены отсутствием доступных вакцин и эффективных терапевтических мер: вирус АЧС способен вмешиваться в различные клеточные сигнальные пути, приводя к иммуномодуляции, что делает разработку эффективной вакцины крайне сложной задачей [8, 13]. Предлагаемые ранее инактивированные вакцины не обеспечивали формирования протективного иммунитета, и роль антител в защите от летального заражения остается неясной. Использование живых аттенуированных вакцин, хотя и обеспечивает приемлемые уровни защиты, представляет трудности из-за наличия побочных эффектов у вакцинированных животных. Сообщалось, что некоторые белки вируса африканской чумы свиней индуцируют нейтрализующие антитела у иммунизированных свиней, а стратегии вакцинации основаны на ДНК-вакцинах и рекомбинантных белках, однако этот подход ограничен выбором систем доставки и подбором антигенов [4].

В связи с этим значительный интерес представляет разработка кандидатных вакцин на основе вирусных векторов. Такие вакцины, основанные на доставке одного или нескольких антигенов, закодированных в контексте неродственного модифицированного вируса, представляют собой широкоприменимую платформу, обладающую множеством преимуществ по сравнению с традиционными технологиями создания вакцин [15]. Основные преимущества вирусных векторов заключаются в высокой эффективности генной трансдукции, высокоспецифичной доставке генов к клеткам-мишеням, индукции устойчивых иммунных ответов и повышении клеточного иммунитета.

Сборка вирусных векторов является сложным многокомпонентным процессом, требующим сочетания традиционных подходов и новых технологий, необходимых для разработки надежных и масштабируемых производственных процессов. При создании генетических конструкций одной из первых осуществляемых процедур является наработка фрагментов целевой ДНК или готовых плазмид в препаративных количествах. На количество копий плазмиды влияют репликативные особенности клетки-хозяина, а также условия культивирования, в частности, скорость роста, состав питательных сред и температурные режимы [1, 7].

Основные методы получения плазмидной ДНК включают этапы культивирования бактерий, их сбора и лизиса, выделения и идентификации плазмидной ДНК [5]. От степени очистки ДНК зависят эффективность её рестрикции, качество процедур секвенирования и подготовки фрагментов для проведения последующих этапов клонирования и трансфекции соматических клеток [1].

Целью данного исследования явилась оптимизация условий получения плазмидной ДНК E. coli с фрагментами генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса АЧС.

Материал и методы исследований. 1. Клонирование генов. Аминокислотные последовательности белков p30, p54, pp60 (pp62) и p72 вируса АЧС на основе эпидемиологически значимого изолята Georgia 2007/1 использовали для конструирования синтетических генов, кодон которых оптимизирован для экспрессии белка в организме хозяина. Оптимизация кодонов, синтез гена, клонирование в pAAV-MCS – плазмиду, содержащую трансген и его регуляторные элементы, фланкированные ITR, а также проверка последовательностей генов были переданы на аутсорсинг (ЗАО «Евроген», Россия). Созданные конструкции были подтверждены секвенированием ДНК.

• 2.    Трансформация компетентных клеток. Компетентные клетки E. coli (штамм DH5α) трансформировали методом теплового шока в присутствии ионов Ca²⁺ [12]. К 100 мкл стока компетентных клеток c концентрацией не менее 1×10⁶ КОЕ/мл добавляли 50 нг соответствующей плазмиды, инкубировали во льду в течение 20-30 мин, после чего подвергали тепловому шоку при 42ºС в течение 2 мин. После повторной инкубации во льду в течение 2 мин к клеткам добавляли 1 мл лизогенной среды (LB) и инкубировали в течение 1 ч при 37 ºС. Суспензию трансформированных клеток высевали по 100 мкл на L-агар, содержащий ампициллин в концентрации 200 мкг/мл. Выросшие клоны культивировали на аналогичной LB-Am+ среде.

• 4.    Выделение плазмидной ДНК проводили при помощи набора «Plasmid MidiPrep 2.0» (Евроген, Россия) согласно инструкции производителя. Концентрацию выделенной ДНК определяли с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США) при OD 260 . Чистоту выделенного препарата оценивали по соотношению показателей OD 260 и OD 280 ; оптимальное соотношение, близкое к значению 1,8, указывало на отсутствие посторонних примесей в препарате.

• 5.    Постановка ПЦР. Поиск нуклеотидных последовательностей для разработки специфичных праймеров, фланкирующих гены CP204L, E183L, CP530R, B646L штамма Georgia 2007/1 вируса АЧС осуществлялся по базам Национального Центра Биоинформатики (NCBI). В качестве положительного контрольного образца (ПКО) использовали рекомбинантные плазмиды на основе векторной плазмиды pAAV-MCS (ЗАО «Евроген», Россия) со встроенной целевой нуклеотидной последовательностью. Состав реакционной смеси для ПЦР-амплификации был следующим (из расчета на одну пробу): 100 пМ растворы прямых и обратных праймеров – по 0,5 мкл; реакционная смесь qPCRmix-HS SYBR с интеркалирующим красителем SYBR Green I (ЗАО «Евроген», Россия) – 5 мкл;

деионизированная вода – 14 мкл; раствор выделенной ДНК (матрица) – 5 мкл. Общий объём реакционной смеси составлял 25 мкл. Постановку ПЦР осуществляли на амплификаторе С1000 с оптическим блоком CFX96 (Bio-Rad, США) согласно следующей программе амплификации: (I) денатурация ДНК при 95 ºС в течение 3 минут; (II) 40 циклов, состоящих из: 15 секунд при 95 °C, 30 секунд при 57 °C, с детекцией флуоресценции по каналу FAM на каждом из циклов при 57 ºC.

Учёт результатов ПЦР проводили методом электрофоретического разделения в 1 % агарозном геле в буфере ТBЕ при напряжении 0,6 В/см2 в течение 30 минут с последующим детектированием в УФ-свете после окраски бромистым этидием. В качестве стандарта при определении длин, полученных ампликонов использовали маркер GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, США) с линейкой фрагментов от 250 до 10000 п.о.

Результат исследований. Скрининг был направлен на выявление генов вируса АЧС, ответственных за индукцию специфического гуморального и клеточного иммунитета и осуществлялся с использованием биоинформатических серверов. В качестве основных иммуномодулирующих белков были выбраны p72 (ген B646L) – высококонсервативный мажорный антиген; полипротеин pp62 (ген CP530R), являющийся предшественником полноценных p35 и p15, определяющих процесс сборки вирусного капсида; p54 (ген E183L) – трансмембранный гликопротеин, участвующий в сборке прекурсоров вирусного капсида и обеспечивающий адсорбцию вируса к клеточной мембране; p30 (ген CP204L) – фосфопротеин, синтезирующийся на ранних стадиях инфекционного цикла и ответственный за интернализацию вируса в клетку [3, 6, 9]. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей вышеуказанных генов различных штаммов и изолятов вируса АЧС из Африки, Европы, Латинской Америки и Российской Федерации продемонстрировал полное соответствие генетических маркеров на основе выбранных локусов. Также были выявлены наиболее перспективные для разработки кандидатной вакцины участки аминокислотных последовательностей белков, вызывающих иммунную реакцию с наибольшей частотой и, вероятно, являющихся наиболее иммуногенными фрагментами (Таблица 1).

Таблица 1 – Наиболее иммуногенные фрагменты иммунодоминатных белков вируса АЧС

Учитывая высокую гомологичность аминокислотных последовательностей рассматриваемых белков, можно предположить, что вакцина, разработанная на основании комплекса антигенов p72, pp60, p54 и p30, может быть применима не только на территории Российской Федерации, но и на территориях стран Восточной Европы.

• 1.    Дизайн праймеров. На основании анализа данных литературы и проведённого анализа расположения генов

  CP204L, E183L, CP530R, B646L на карте генома изолята Georgia 2007/1 вируса АЧС определили оптимальные участки для дизайна праймеров. С помощью программного обеспечения Vector NTI 9.0 (Thermo Fisher Scientific, США) выполнили дизайн 4 пар праймеров, фланкирующих фрагменты перечисленных генов, после чего была проведена оптимизация условий постановки ПЦР. В результате экспериментов нами были определены оптимальные режимы амплификации и

• концентрации реакционных смесей. Подобранные пары праймеров были проверены на специфичность обнаружения плазмидной ДНК и показали строгую специфичность к выявляемым локусам ввиду отсутствия перекрёстных реакций с отрицательными и гетерологичными контрольными образцами.

• 2.    Наработка плазмидных ДНК в препаративных количествах. В ходе проведённых экспериментов нами были определены оптимальные условия трансформации компетентных клеток E. coli и масштабного культивирования трансформантов с целью выделения плазмидных ДНК в препаративных количествах. Было установлено, что перечисленная последовательность действий позволяет получить очищенный препарат плазмидной ДНК с фрагментами генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса АЧС, с концентрацией не менее 300 мкг/мл.

Заключение. Осуществлено клонирование генов CP204L, E183L, CP530R, B646L штамма Georgia 2007/1 вируса АЧС и получены клоны E. Coli для наработки плазмид с соответствующими вставками в препаративных количествах. Определены условия культивирования и выделения, обеспечивающие достаточный выход очищенных препаратов плазмидных ДНК. Описанные подходы в дальнейшем будут использованы для сборки векторов на основе аденоассоциированного вируса (ААВ), способных обеспечить высокую эффективность трансдукции эукариотических клеток, и, следовательно, для формирования безопасной и эффективной стратегии создания кандидатной вакцины против АЧС.