Опыт усовершенствования инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза рогатого скота

В настоящее время достоверно доказано, что успешная ликвидация хламидиоза в животноводческих хозяйствах возможна только на фоне противохламидийного иммунитета. Этот факт обуславливает применение в неблагополучных хозяйствах вакцин, индуцирующих в организме животных выработку напряженного противохламидийного иммунитета, способного противостоять заражению. Но при конструировании таких вакцин, в связи со слабой иммуногенной активностью хламидийных антигенов, возникает необходимость использования адъювантов.

На сегодняшний день практически все противохламидийные вакцины представляют собой прямую эмульсию (вода в масле) на основе неполного адъюванта Фрейнда (НАФ), который значительно усиливает иммунный ответ при совместном использовании с инактивированными хламидийными антигенами. Однако применение НАФ может вызывать нежелательные побочные эффекты в виде гранулем и стерильных абсцессов на месте инъекции, поэтому изыскание эффективных адъювантов, способных стимулировать высокий уровень противохламидийного иммунитета и не вызывать побочных реакций, остается актуальной задачей в течение многих лет.

Ранее нами была разработана технология получения инактивированных эмульсионных вакцин против хламидиоза (патент РФ №2301682 06.2007) в составе которой применяется НАФ. На основе этой технологии были созданы и внедрены в ветеринарную практику «Вакцина против хламидиоза рогатого скота инактивированная эмульсионная» (Регистрационный № ПВР-1-1.8/02340), «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная» (Регистрационный № ПВР-1-1.8/02339) и «Ассоциированная вакцина против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС инактивированная эмульсионная» (Регистрационный № ПВР-1-4.8/02246).

Наиболее широко при конструировании эмульсионных вакцин типа «вода в масле» для рогатого скота и свиней применяется готовый коммерческий адъювант Мontanide ISA 70 производства фирмы Seppic. В отличие от НАФ который образует эмульсию с водной антигенной средой в равных соотношениях (1:1) он эмульгируется в соотношении 7 частей адъюванта к 3 частям воды (антигена), тем самым обладая меньшей вязкостью и реактогенностью.

Мы попытались усовершенствовать НАФ (УНАФ), смешивая его с водной средой в тех же пропорциях, что и ISA-70 (7:3). Это позволило уменьшить количество эмульгатора в составе адъюванта и тем самым понизить его местную реактогенность. Далее создать на основе такого адъюванта вакцину и сравнить её с аналогами на основе НАФ и ISA.

Биомассу для полишаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота получали на основе 3-х штаммов хламидий: «СК» -возбудителя конъюнктивита телят, «МЗ» - возбудителя менингоэнцефалита КРС и «250» - возбудителя аборта коров. Все штаммы депонированы в «ВГНКИ» и стандартизированы согласно СТО 00492374004-2008.

Антиген для вакцин стандартизировали по оптической плотности. Для вариантов вакцин, которые смешиваются 7:3, подбирали соответственную концентрацию антигена путем её пропорционального увеличения. Водную часть и адъювант при изготовлении трех вакцин смешивали в аналогичных условиях механическим способом при частоте вращения вала мешалки 3000-4000 об/мин в течение 3-5 минут при комнатной температуре и разливали в стерильные стеклянные флаконы.

Качество вакцин проверяли согласно ТУ 9384-002-00492374-2009, утвержденным в установленном порядке. Вакцины проверялись по внешнему виду, стабильности и вязкости эмульсии, стерильности, безвредности и антигенной активности.

Стабильность эмульсии проверяли путем её замораживания при минус 400С и дальнейшего оттаивания при плюс 370С. Стабильность и внешний вид оценивали визуально.

Кинематическую вязкость вакцин устанавливали при помощи вискозиметра ВПЖ-2 путем пропускания определенного объема эмульсии через капилляр с диаметром 2,37 мм под собственной силой тяжести, засекая промежуток времени. Вязкость вычисляли по формуле V=g/9,807×T×K, где V – кинетическая вязкость мм2/с, g – ускорение свободного падения в месте измерения, К – постоянная вискозиметра, Т – время истечения жидкости.

Стерильность препаратов определяли в соответствии с ГОСТ 28085 путем их высева на МПА, МПБ, Сабуро-агар, среду Китт-Тароцци с последующим помещением в термостат при плюс 370С и наблюдением в течение 10 дней.

Безвредность определяли на белых мышах массой 18-20 г. путем внутрибрюшинного введения вакцин в дозе 0,2 см3 и дальнейшего наблюдения за мышами в течение 2-х недель. Использовали 60 голов белых мышей: по 15 голов на каждую вакцину и 15 контрольных.

Антигенную активность и местную реакцию на введение биопрепаратов проверяли на морских свинках, клинически здоровых, массой 350 – 400 г. 16 голов морских свинок разделили на 4 равные группы, 3 из которых вакцинировали внутримышечно в дозе 0,5 см3 разными вариантами вакцин, а 4 группу не вакцинировали и держали в качестве контроля. После вакцинации проводили ежедневную термометрию и клинический осмотр свинок. Через месяц сыворотки крови опытных и контрольных свинок исследовали в РСК для определения уровня специфических антител.

РСК ставили по общепринятой методике используя «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» (№ РОСС RU. ФВ01. Н21898) производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Результаты оценивали визуально, по феномену гемолиза эритроцитов. Отсутствие гемолиза эритроцитов оценивали как положительную реакцию (4 креста), а полный гемолиз соответственно как отрицательную реакцию.

Изучение внешнего вида и стабильности эмульсии трех образцов вакцин показало, что все они удовлетворяют предъявляемым требованиям. Вакцины представляли из себя эмульсию белого цвета. Разрушения эмульсии во всех трех образцах после охлаждения и нагрева не происходило. В образце вакцины, приготовленном на основе усовершенствованного адъюванта (УНАФ), наблюдалось незначительное отслоение (1-2% от объема) масла вверху флакона, которое равномерно распределялось при встряхивании биопрепарата.

Данные по испытанию вакцин обобщены в таблице 1.

1. Результаты испытания вакцин

Наименование показателей	Варианты вакцин на основе			Контроль
	НАФ	ISA-70	УНАФ
1. Внешний вид	Удовл.	Удовл.	Удовл.	-
2. Стабильность эмульсии	Стабильна	Стабильна	Стабильна	-
3. Вязкость эмульсии, мм2/с	203	47	81	-
4. Стерильность	Стерильно	Стерильно	Стерильно	-
5. Безвредность, % выживаемости белых мышей	100	93	100	93
6. Антигенная активность, средний титр к/с антител	1:27,5	1:7,5	1:12,5	0

Определение вязкости вакцин показало значительные различия трех изучаемых образцов. Так, наибольшей вязкостью обладал образец, изготовленный на основе НАФ. Его вязкость составила 203 мм2/с. Вязкость вакцины на основе УНАФ была значительно ниже и составляла 81 мм2/с. Наименьший показатель вязкости – 47 мм2/с был зафиксирован у биопрепарата, изготовленного на основе ISA-70.

При определении стерильности было установлено, что все вакцины не давали роста бактериальной и грибной микрофлоры на питательных средах в течение срока наблюдений.

Испытание безвредности вакцин показало, что после вакцинации ухудшения состояния у мышей не наблюдалось. Выживаемость мышей, как в опытных, так и в контрольной группах была высокой (93–100%), что говорило о безвредности проверяемых биопрепаратов.

Изучение антигенной активности трех образцов вакцины показало существенные различия в титрах, вырабатываемых комплементсвязывающие антитела. Так, в ответ на введение вакцины изготовленной на основе НАФ у морских свинок вырабатывался сравнительно высокий уровень антител. Средний титр по этой группе составил 1:27,5. Несколько ниже титр антител был в группе морских свинок, иммунизированных вакциной на основе УНАФ – 1:12,5. Наименьшую антигенную активность проявил биопрепарат, изготовленный на основе ISA-70. Средний титр антител у животных в этой группе был на уровне 1:7,5. У контрольной группы морских свинок специфических антител к хламидийному антигену выявлено не было.

Наблюдения, проводимые за вакцинированными и контрольными свинками в течение опыта, не выявляли клинических признаков ухудшения состояния после прививки. Температурных реакций на введение вакцин также не наблюдали. На месте введения вакцины, изготовленной на основе НАФ, у морских свинок наблюдалось небольшое уплотнение, которое постепенно исчезло к концу срока наблюдения.

Таким образом, в ходе исследований удалось установить, что все испытуемые адъюванты образуют стойкие эмульсии с водным хламидийным антигеном. Вакцины изготовленные на их основе, стерильны и безвредны для лабораторных животных. Однако в ходе эксперимента установлены существенные различия в вязкости, реактогенности и антигенной активности испытуемых биопрепаратов.

Так, вакцина, изготовленная на основе НАФ, обладала наибольшей вязкостью и проявляла слабую реактогенность. Но антигенная активность этой вакцины была в разы выше по сравнению с другими препаратами.

Изготовленная на основе ISA-70 вакцина обладала наилучшими показателями по вязкости, реактогенности и стабильности эмульсии, но к сожалению, антигенная активность этого биопрепарата была низкой.

Наиболее оптимальными показателями, удовлетворяющими всем требованиям по вязкости, реактогенности и антигенной активности обладала вакцина, изготовленная на основе УНАФ. Она не обладала реактогенностью, показатели её вязкости были близки к препарату, изготовленному на основе ISA-70, а антигенная активность была выше, хотя уступала по этому показателю вакцине на основе НАФ.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Хамадеев Р.Х., Евстифеев В.В., Хусаинов Ф.М., Барбарова Л.А. Хламидиоз сельскохозяйственных животных: диагностика, меры борьбы и специфическая профилактика. // Ветеринарный врач 2006.-№ 1. С.29-31. 2. Хусаинов Ф.М., Евстифеев В.В., Барбарова Л.А. Оценка эффективности средств специфической профилактики хламидиозов рогатого скота и лошадей в хозяйствах Российской Федерации.// Научнотехнический бюллетень института биологии животных.- Львов, Выпуск 10. №3.- 2009.- С.192-195. 3. Шемельков Е., Федоров Ю. Антигенная активность вакцины против инфекционных болезней свиней при включении в ее состав адъювантов.// Ветеринария сельскохозяйственных животных 2011 №4. С.21-25. 4. Мечников И.И. Иммунология.// Издательство “Медицина” 2011.- №1 С.37-43. 5. Мечников И.И. Иммунология.// Издательство “Медицина” 2011.- №2 С. 101-106.

ОПЫТ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ХЛАМИДИОЗА РОГАТОГО СКОТА

Евстифеев В.В., Хусаинов Ф.М., Барбарова Л.А., Хусаинова Г.И., Мифтахов Н.Р., Нигъматуллина Д.И.

Резюме

В работе изложены результаты испытания 3 вариантов инактивированных эмульсионных вакцин против хламидиоза рогатого скота, изготовленных на основе разных адъювантов.

Установлено, что все испытуемые адъюванты образуют стойкие эмульсии с хламидийным антигеном. Вакцины, изготовленные на их основе стерильны и безвредны для лабораторных животных. Однако в ходе эксперимента установлены существенные различия в вязкости, реактогенности и антигенной активности испытуемых биопрепаратов.

EXPERIENCE OF IMPROVEMENT OF AN INACTIVATED EMULSION VACCINE AGAINST CHLAMYDIOSIS CATTLE

Evstifeev V.V., Khousainov F.M., Barbarova L.A., Khusainova G.I., Miftahov N.R., Nigmatullina D.I.