Основы взаимодействия NO-терапии и лимфотропной антибиотикотерапии при лечении трофических язв

Лечение трофических, длительно не заживающих язв является одной из наиболее сложных проблем хирургии [15]. С давних пор в качестве лечебных средств использовали различные химические и биологические антисептики [13]. Тем не менее, несмотря на положительные отзывы об эффективности этих средств, в терапии трофических язв они не получили широкого признания. Причина тому – их малая эффективность. Хорошо известно, что, в частности антибиотики, даже самые эффективные, изменяют микробный пейзаж, но не уничтожают его полностью. Грануляционная ткань трофических язв создает надежный барьер, не позво- ляющий вегетирующей флоре перейти в активную раневую инфекцию.

В настоящее время в хирургии пользуется популярностью и исследовательским интересом экзогенный оксид азота (NO). В 1998 г. R. Furchott, F. Murad и L. Ignarro [23] получили Нобелевскую премию за серию исследований «Монооксид азота как сигнальная молекула в сердечно-сосудистой системе». В нашей стране пионером научных изысканий использования оксида азота в медицинской практике заслуженно считается А.Ф. Ванин [1]. В организме человека и животных оксид азота выполняет координирующую функцию, из-за чего получил название «сигнальной молекулы».

В 1997 г. группой специалистов ММА им. И.М. Сеченова, МГТУ им. Н.Э. Баумана и МНИИОИ им. П.А. Герцена был открыт неизвестный ранее феномен выраженной стимуляции заживления ран, особенно длительно незаживающих, периферийной (охлажденной) областью воздушно-плазменного потока отечественного аппарата «Плазон», разработанного в МГТУ им. Н.Э. Баумана для теплового (деструкция и коагуляция) воздействия на ткани [10, 11]. Воздушно-плазменный аппарат «Плазон» оказался уникальным генератором оксида азота из воздуха [9].

Оксид азота нашел наибольшее применение в гнойной хирургии. Широкая популярность экзогенного оксида азота обусловлена доказанным полигамным комплексом его патогенетического влияния на заживление раны, включая выраженный антисептический эффект и стимуляцию регенераторных процессов [3, 22, 24]. Это обеспечивается продуцированием его NOS-эндотелиальной и NOS-нейрональной изоформ, вырабатываемых в различных клетках и тканях под действием цитокинов и иных биологически активных веществ. Большое значение имеет участие эндогенного оксида азота в развитии воспалительных реакций. Это определяется антимикробным эффектом NO за счет стимуляции макрофагов, индукции цитокинов, Т-лимфоцитов и ряда иммуноглобулинов, а также за счет его взаимодействия с кислородными радикалами, оказывая регулирующее влияние на микроциркуляцию, обеспечивая цитотоксический или цитопротективный эффект в зависимости от конкретных условий [8, 17, 19].

Совокупность имеющихся данных позволила выдвинуть подтвержденную в дальнейшем гипотезу о доминирующей роли NO в обнаруженном эффекте биостимуляции и предложить принципиально новый способ лечения раневой патологии острых и хронических воспалительных процессов. Достигается не только купирование воспалительной реакции, но и ликвидация раневого дефекта в целом, что позволило назвать этот метод NO-терапией. Апробация метода в военно-полевой хирургии подтвердила ее положительное влияние на заживление ран огнестрельного происхождения [6, 14]. Доказано, что в тканях раневой зоны в воспалительную и пролиферативную фазы процесса увеличивается активность индуцибельной и эндотелиальной NOS. С уровнем их активности связан функциональный статус макрофагов, синтез цитокинов и пролиферация фибробластов, эпителизация и заживление ран в целом. При осложненном течении раневого процесса, при трофических язвах и других видах хронических ран снижается активность NO-синтез и выработка NO, которые определяют замедленное заживление. В дальнейшем была выдвинута и подтверждена гипотеза, в соответствии с которой эндогенному оксиду азота отводится доминирующая роль в биостимуляции репаративных реакций [12, 18, 21].

Все же анализ этих и многих других публикаций, в которых «поется гимн» экзогенному оксиду азота как действенному средству лечения ран, невольно провоцирует появление сомнений – так ли уж эффективен этот метод. Дело в том, что в научных исследованиях последних лет все чаще звучат при- зывы дополнять NO-терапию ран и раневой инфекции фотодинамическим воздействием, биологическими и биосинтетическими покрытиями, антиоксидантами и др. [4, 5].

Лимфотропное введение лекарственных препаратов способно создать большие концентрации препарата в органах и тканях по сравнению с таковыми при внутримышечном и внутривенном введениях. Терапия, проводимая через лимфатическую систему, обеспечивает длительное удержание в мягких тканях конечностей, регионарных лимфатических узлах и крови терапевтической концентрации препарата при уменьшении общей вводимой дозы и кратности его введения [2]. Быстрая ликвидация интерстициального отека и региональная детоксикация также способствуют предотвращению развития гнойных осложнений.

Цель исследования

Изучение влияния оксида азота на эндотелий кровеносных микрососудов на фоне экспериментальной инфицированной раны.

Материалы и методы исследования

Репаративная регенерация эпителия зависит от новообразования капиллярных сетей. Предварительно в эксперименте мы изучили влияние оксида азота на пролиферативную активность эндотелия микрососудов кожи в условиях экспериментального воспаления, так как важную роль в процессе неоангиогенеза играют эндотелиоциты, которые в норме (у интактных животных) имеют крайне низкие показатели пролиферативной активности, что является результатом контактного торможения популяции клеток.

Экспериментальные животные (белые крысы линии Wistar) были разделены на три группы: 1-я группа – интактные животные; 2-я группа – животные с экспериментальным воспалением, которым проводили традиционное лечение; 3-я группа – животные с экспериментальным воспалением, которым ежедневно обрабатывали зону воспаления с помощью оксида азота от аппарата «Плазон» с содержанием NO в газовом потоке 300 ppm, с экспозицией 10–15 сек. на 1 см2. Модель экспериментального воспаления создавали путем подкожного введения 6∙1010 микробных тел в 1 мл объема культуры золотистого стафилококка (штамм 13407) в область средней трети бедра крысы. Забор биоматериала проводили через 1, 3, 5 и 7 суток от начала лечения. Пролиферативную активность эндотелия микрососудов определяли методом иммуногистохимии. Ядер-ный антиген клеток, потенцированных к митозу, выявляли с помощью моноклональных антител PCNA. Он соединяется с белком циклином, присутствующим только в делящихся или готовых к делению клетках. Препараты изучали на светооптическом уровне. За единицу измерения брали одну окрашенную клетку (ОК).

Под нашим наблюдением находилось 186 больных с трофическими язвами нижних конечностей. Преобладали женщины (62,9%) в возрасте старше 50 лет (46,2%). Средний возраст составил 55,4±3,7 года.

У 162 больных язвы локализовались на внутренней поверхности нижней трети голени, в области медиальной лодыжки, у 24 пациентов имелась другая локализация. Язвы имели округлую или овальную форму. Дно язв было глубоким, покрыто гнойно-некротическим налетом. Кожа вокруг язв на протяжении нижней и средней трети голени была пигментирована, уплотнена, с явлениями дерматита. Площадь язвенных дефектов имела размеры от 5 до 80 см2. У 98 (52,7%) больных язвенные дефекты имели размеры до 10 см2, у 47 (25,3%) – до 40 см2, у 41 (22%) пациентов – до 80 см2. У 86 больных (46,2%) отмечено вовлечение в воспалительный процесс паховых лимфатических узлов.

Результаты бактериологического исследования обсе-мененности язвенных дефектов у пациентов до начала лечения показали наличие ассоциативной микрофлоры ( Pseudomonas aerugenosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Esherichia coli, Proteus vulgaris и Klebsielle oxyfoca ). В 15% наблюдений высевалась смешанная флора, как правило, Staphylococcus aureus и Esherichia coli . Уровень бактериальной обсемененности трофических язв на 1 г ткани у больных составил 168,91 х 10⁹±48,12 х 10⁹.

Относительно чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам заметим, что наибольшим эффектом (92–98%) обладают препараты из группы цефалоспоринов, фторхинолонов и карбапенемов.

В связи с тем, что после лимфотропного введения терапевтическая концентрация цефотаксима сохраняется 36 ч, мы решили использовать этот антибиотик для лимфотропного введения. Антибиотик вводили 1 раз в сутки, в разовой дозировке под кожу на передней поверхности бедра без последующего массажа и введения ферментов. Лечение проводили ежедневно. На курс лечения, в зависимости от тяжести патологического процесса, выполняли от 6 до 10 сеансов. Мы решили сочетать лимфотропную терапию и терапию оксидом азота, под воздействием которого увеличивается протяженность фармакокинетической кривой. Создание повышенной концентрации антибиотика в лимфатических узлах обеспечивает потенцированный антибактериальный эффект [7, 16].

На фоне лимфотропной терапии обрабатывали язву оксидом азота в режиме NО-терапии от аппарата «Плазон» с содержанием оксида азота в газовом потоке 300 ppm. Площадку диаметром около 2 см2 обрабатывали в течение 8–10 сек. с расстояния 10–15 см от выходного отверстия аппарата. Сеансы проводили ежедневно, всего на курс лечения 9–10 сеансов, в зависимости от тяжести патологического процесса. Пациенты группы сравнения получали традиционную терапию.

Результаты и их обсуждение

Анализ полученных данных показал, что у интактных животных пролиферативная активность эндотелиоцитов практически отсутствует и составляет 0,7±0,03 ОК (окрашенных клеток).

У животных 2-й группы количество клеток увеличивается к третьим – пятым суткам от начала опыта (7,8,±1,13 ОК), а к седьмым суткам достигает довольно высоких значений

(19,71±2,17 ОК), что позволяет считать возможным образование эндотелиальных клеток, преформирующихся в будущие кровеносные капилляры методом почкования, т.е. процесс ангиогенеза становится более активным.

Обработка раны оксидом азота стимулирует пролиферацию эндотелиоцитов уже в первые сутки (10,97±1,53 ОК), а к третьим – пятым суткам количество способных к митозу клеток увеличивается в 3 раза и составляет 31,63±2,78 ОК. К седьмым суткам процесс накопления клеточной массы стабилизируется на значениях 29,91±2,14 ОК. Вновь образованные эндотелиальные клетки в дальнейшем преформируются в будущие кровеносные капилляры, т.е. процесс ангиогенеза становится более активным.

Таким образом, NO-терапия способствует значительному увеличению монослоя эндотелия за счет пролиферации клеток и по сравнению с традиционными способами лечения гнойных ран обладает выраженной конкурентной направленностью. С биологической точки зрения увеличение количества эндотелиоцитов также имеет большое значение, поскольку на сегодня установлен факт передачи сигналов в биосистемах с помощью NO. Оксид азота, вырабатывающийся в эндотелиальных клетках, проникает через мембраны и регулирует функции других клеток.

В цитограмме отпечатков с язв у больных до лечения отмечалось до 95,8±1,3% нейтрофильных лейкоцитов, большинство из которых находилось в состоянии дегенерации и деструкции. Характерной особенностью цитологической картины явилось почти полное отсутствие макрофагов и лимфоцитов, что свидетельствовало о значительном снижении клеточного иммунитета и отсутствии процессов регенерации.

У больных основной группы уже после 3–4 сеансов NО-терапии на фоне лимфотропного введения антибиотика отчетливо отмечалось стихание воспалительных явлений. Уменьшались гиперемия и отек тканей, снижалась интенсивность болей. Активнее, чем у больных группы сравнения, проходили процессы очищения язвы.

При контрольном бактериологическом исследовании содержимого из язв отсутствие роста микрофлоры отмечено у 83,8% больных основной группы после 7,1±0,5 сеансов NO-терапии.

При цитологическом исследовании отделяемого из язвы на 3-и сутки от начала лечения в основной группе больных установлено уменьшение количества клеточного детрита, количество нейтрофилов составило 75,6±1,7% и увеличилась их сохранность с 15% до 55–60%. На долю лимфоцитов и моноцитов приходилось 10–15% клеток, т.е. цитологическая картина соответствовала дегенеративно-регенераторному типу клеточной реакции. У больных группы сравнения цитологическая картина характеризовалась дегенеративно-воспалительным типом. К 7-м суткам цитологическая картина в основной группе имела выраженный регенераторный характер, а у больных группы сравнения – воспалительно-регенераторный.

Нами проанализированы результаты лечения больных основной и группы сравнения по срокам очищения трофической язвы, появления грануляций и эпителизации (табл.).

Таблица

Сроки очищения и эпителизации трофических язв на фоне NO-и лимфотропной антибиотикотерапии

Группы больных	Сроки в сутках (M ± m)
	Очищение	Грануляции	Краевая эпителизация
Основная группа	3,9±0,2 р<0,05	7,3±0,3 р<0,05	9,2±0,1 р<0,05
Группа cравнения	7,2 ± 0,4	15,2 ± 0,2	26,1 ± 0,3

Как видно из таблицы, очищение трофических язв у больных основной группы наступало на 3,9±0,2 сутки. На 7,3±0,3 сутки в дне язвы появлялись единичные грануляции яркокрасного цвета в виде островков, которые, сливаясь, покрывали раневую поверхность. Эпителизация язв начиналась с 7-х суток и происходила не только от краев, но и из дна язвы в виде дорожек и мостиков. Максимальная скорость эпителиза-ции приходилась на 9,2±0,1 сутки.

У больных группы сравнения в этот же период явления воспаления сохранялись, появлялись единичные грануляции, а признаки эпителизации отсутствовали.

На 14,2±0,2 сутки у больных основной группы язвы были сплошь покрыты грануляциями с выраженной краевой эпите-лизацией. У пациентов группы сравнения краевая эпителиза-ция начиналась на 26,1±0,3 сутки, т.е. в 1,8 раза позднее, чем у больных основной группы.

Сроки заживления у больных основной группы составили 15,2±0,2 сутки, что в 2 раза меньше, чем при традиционном лечении.

Результаты морфологических исследований в динамике свидетельствовали о повышении фагоцитарной активности макрофагов, активной пролиферации фибробластов, синтезе коллагена, т.е. о повышение тканевого иммунитета под воздействием NO-терапии через 14 дней от начала лечения и образовании полноценной грануляционной ткани. В группе сравнения отмечено появление макрофагов и отдельных фибробластов только к 26,1±0,3 суткам.

Через 15,8±0,4 суток у всех больных основной группы язвы полностью эпителизировались, тогда как в группе сравнения лишь у половины больных наступила полная эпителизация язв.

Выводы

Таким образом, комплексное лечение трофических язв смешанного генеза в режиме NO-терапии от аппарата «Плазон» на фоне лимфотропного введения антибиотика позволяет сократить сроки амбулаторного лечения и клинического выздоровления пациентов в 2 раза, а также уменьшить число рецидивов в 4 раза за счет бактерицидного действия, улучшения микроциркуляции, ускорения созревания грануляционной ткани. В сроки до 3 лет рецидив трофических язв имел место у 6 человек (5,8%). У больных группы сравнения рецидив имел место у всех пациентов.