Особенности базальной и стимулированной секреции интерлейкинов 2 и 4 мононуклеарами крови при аутоиммунном диабете

В настоящее время отмечается неуклонный рост заболеваемости сахарным диабетом (СД) во всех возрастных и этнических. Углубление понимания механизмов формирования диабета позволяет объяснить его клиническую гетерогенность и обосновать необходимость дифференцированной терапии. Если дебют СД приходится на период от 18 до 40 лет, могут иметь место различные его патогенетические варианты, требующие дифференцированной терапевтической тактики [2]. Аутоиммунный диабет может развиться в любом возрасте. Среди пациентов с СД обозначилась особая группа больных латентным аутоиммунным диабетом взрослых (LADA) [8]. Основным лабораторным критерием LADA является наличие циркулирующих антител к клеткам панкреатических островков. Для LADA характерна острая манифестация в возрасте от 30 до 50 лет и отсутствие абсолютной инсулиновой недостаточности в последующие 6 месяцев [7, 16]. В качестве клинических критериев диагноза LADA также используются индекс массы тела (ИМТ) менее 25, личный и семейный анамнез аутоиммунных заболеваний [7]. В результате иммунного повреждения островков у этих больных уже в начале заболевания отмечается снижение секреторной реакции β-клеток на стимуляцию глюкозой или глюкагоном [21]. Имеющиеся в литературе данные позволяют считать, что медленное повреждение β-кле-ток при LADA не является случайным, а отражает патогенетические особенности функционирования Т-звена иммунитета, отличные от механизмов развития классического СД типа 1. В настоящее время в качестве ключевых звеньев патогенеза повреждения β-клеток рассматриваются аутоиммунные механизмы, глюкозо- и липо-токсичность, а также системный окислительный стресс и цитокиновый дисбаланс [9].

В 1986 г. Mosmann и сотрудники предложили модель Th1/Th2 – поляризации иммунного ответа, постулирующую, что эти клеточные типы находятся во взаимоотношениях контррегуляции посредством продукции цитокинов [6, 18]. Считается, что Th1-клетки играют главную роль в патогенезе аутоиммунного диабета. Напротив, предполагается, что цитокины профиля Th2 могут быть протективными, подавляя патологический аутореактивный ответ 1 типа и поддерживая толерантность.

Цель работы – проанализировать зависимость базальной и фитогемагглютинин-стимулированной продукции мононуклеарами IL-2 и IL-4 от клинического типа диабета, стажа заболевания, индекса массы тела пациента, потребности в инсулине. То есть установить взаимосвязь между клиническими проявлениями сахарного диабета и поляризацией в системе Th1/Th2.

Материал и методы

Группу больных с СД типа 1 составили 8 человек, средний возраст – 36,5±2,3 года, длительность заболевания – 9,5±2,8 года. Диагноз СД типа 1 устанавливался на основании развития кетоацидоза в течение первых 6 месяцев от начала заболевания, персистирующей потребности в инсулинотерапии после ликвидации кетоза и достижения метаболической компенсации.

Группу больных с СД типа 2 составил 21 человек, средний возраст – 52,6±1,1 года, длительность заболевания – 5,3±1 год. Диагноз СД типа 2 устанавливался на основании наличия маркеров метаболического синдрома, постепенного начала заболевания без развития кетоацидоза, отсутствия потребности в инсулинотерапии после ликвидации кетоза и достижения метаболической компенсации как минимум в течение 6 месяцев от начала заболевания.

Группу больных LADA составили 6 человек, средний возраст – 44,2±3,8 года, длительность заболевания – 4,2±1,7 года. Диагноз LADA устанавливался на основании клинических критериев острой манифестации в возрасте от 30 до 50 лет без развития кетоацидоза, отсутствия потребности в инсулинотерапии после ликвидации кетоза и достижения метаболической компенсации как минимум в течение 6 месяцев от начала заболевания. В качестве клинических критериев диагноза LADA также использовался индекс массы тела (ИМТ) менее 25, отсутствие признаков метаболического синдрома, личный и семейный анамнез аутоиммунных заболеваний. В качестве косвенного лабораторного подтверждения LADA рассматривали отсутствие гиперинсулинемии и снижение секреторной реакции р -клеток на стимуляцию смешанной пищей [7, 16].

По стажу заболевания группы были однородны.

Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утором натощак. Кровь стабилизировали гепарином (25 Ед/мл).

Мононуклеары выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин. Для получения супернатантов выделенные мононуклеары ресуспендировали в полной питательной среде, стандартизируя количество клеток в суспензии до 2,0 х 10 6 /мл. Для стимуляции секреторных способностей лимфоцитов в пробы вносили фитогемагглютинин (“Difco”, Германия) с дальнейшей инкубацией клеточных суспензии в течение 24 ч.

Определение спонтанного и ФГА-стимулированного уровней IL-2 и IL-4 в супернатантах проводили с использованием твердофазного иммуноферментного метода по инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем (“Procon”, Россия). Учет результатов иммунофермен- тного анализа производили с помощью фотометра для микропланшетов “Multiscan EX” (“ThermoLabSystems”, Финляндия) при длине волны 450. Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой. Данные выражали в пг/мл.

Исследование соответствовало требованиям локального этического комитета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, разработанными в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации “Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека” с поправками 2000 г. и “Правилами клинической практики в Российской Федерации”, утвержденными Приказом Минздрава Российской Федерации от 19.06.2003 г. №266. Все лица, участвующие в исследовании, дали информированное согласие на участие.

Результаты исследования обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Statistica. for Windows (2000, версия 6.0) фирмы Statsoft Inc. и пакета программ Microsoft Excel (2003). Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения (по критерию Колмогорова-Смирнова). Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характе-ристики:‘ среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследованных выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки статистической значимости различий выборок, не подчиняющихся критерию нормальности распределения, использовали критерии Манна-Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р<0,05. Для выявления функциональных взаимосвязей между изученными параметрами проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Пирсона (r) [2].

Результаты и обсуждение

Известно, что между Th1- и Th2 лимфоцитами существует “антагонизм”, реализуемый с участием их продуктов – IL-2 и IFN-g или IL-4 и IL-10 соответственно. Согласно современным представлениям, поляризация иммунного ответа по Th1-пути играет решающую роль в патогенезе аутоиммунного диабета. Исходя из этого, в ходе настоящего исследования была проведена оценка способности мононуклеаров периферической крови пациентов с сахарным диабетом продуцировать ключевые цитокины, детерминирующие Th1- и Th2-пути IL-2 и IL-4 соответственно (табл. 1).

Интерлейкин-2 (IL-2) – один из важнейших цитокинов профиля Th1. Повышение уровня IL-2 вызывает цепную реакцию повышения содержания других цитокинов.

По данным литературы, у пациентов с впервые выявленным СД типа 1, и их серопозитивных родственников выявляли как повышение сывороточного уровня IL-2, так и повышение его продукции мононуклеарами после стимуляции [1, 5, 13, 14, 19]. С другой стороны, имеются данные, свидетельствующие о снижении уровня IL-2 и его продукции мононуклеарами при СД типа 1 [17, 22].

При исследовании базальной продукции IL-2 отмечалась отчетливая тенденция к более высоким уровням в группе пациентов, страдающих СД типа 1 (138,74±67,99 пг/мл), затем в группе LADA (96,88±51,75 пг/мл), и наименьшим в группе больных СД типа 2 (72,72±19,94 пг/мл). Однако уровень статистической значимости не был достигнут из-за малого объема выборок (р СД типа 1 – СД типа 2=0,22; р СД типа 1 – LADA=0,65; р СД типа 2 – LADA=0,6). Полученные результаты согласуются с данными литературы. Более высокий уровень базальной продукции IL-2 при аутоиммунном диабете отражает Th-1 поляризацию иммунного ответа при этом заболевании. Выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость между уровнем базальной продукции IL-2 и весом при LADA (r=–0,85, p=0,032). Также выявлена статистически значимая обратная связь уровня базальной продукции IL-2 с возрастом при СД типа 2 (r=–0,67, p=0,0009).

При исследовании ФГА-стимулированной продукции IL-2 отмечалась отчетливая тенденция к более высоким уровням в группе пациентов, страдающих СД типа 2 (212,67±103,26 пг/мл), затем в группе LADA (121,89±54,61 пг/мл), и наименьшим в группе больных СД типа 1 (78,23±32,51 пг/мл). Однако уровень статистической значимости не был достигнут из-за малого объема выборок (р СД типа 1 – СД типа 2=0,44; р СД типа 1 – LADA=0,48; р СД типа 2 – LADA=0,65). Полученные результаты отражают истощение функциональных резервов мононукле-аров при аутоиммунном процессе (табл. 1).

Интерлейкин-4 (IL-4) – это ключевой цитокин профиля Th2. Он секретируется активированными Th2-лим-фоцитами, тучными клетками. In vitro IL-4 стимулирует рост Т и В-клеток, регулирует индукцию Th2-ответа, ингибирует макрофаги воспаления и Th1-клетки. Этот цитокин способствует формированию “толерантного Th2-фенотипа”, привлекая В-лимфоциты в качестве “непрофессиональных” антиген представляющих клеток, которые стимулируют развитие анергии в большей мере, чем активации. Более того, IL-4 ингибирует освобождение активированными макрофагами таких провоспалительных

Таблица 1

Уровни базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-2 и IL-4 мононуклеарами периферической крови пациентов с СД

Показатели, пг/мл	СД типа 1, M±m (n=8)	СД типа 2, M±m (n=21)	LADA, M±m (n=6)
Базальная продукция IL-2	138,74±67,99	72,72±19,94	96,88±51,75
ФГА-стимулированная продукция IL-2	78,23±32,51	212,67±103,26	121,89±54,61
Базальная продукция IL-4	29,11±18,52	52,45±23,27	80,61±36,04
ФГА-стимулированная продукция IL-4	3,36±2,36*	11,09±7,96	29,86±13,62*

Примечание: * – cтатистическая значимость различий ФГА-стимулирован-ной продукции IL-4 в группах пациентов с СД типа 1 и LADA p=0,047 по t-критерию Стьюдента; M – выборочная средняя, m – ошибка средней, n – объем выборки.

молекул, как интерлейкин-1, фактор некроза опухолей- α , интерлейкин-8, простагландин Е2 [20].

По литературным данным, IL-4 проявляет защитное действие в моделях аутоиммунного диабета у грызунов [12]. Предварительная инкубация островковых клеток человека с IL-4 предотвращает апоптоз, вызываемый смесью IL-1+TNF- α +интерферон- γ (IFN- γ ). Тем не менее, перенос Th2 клонов мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом может вызвать инсулит и СД, и в некоторых условиях трансгенная экспрессия IL-4 способствует развитию аутоиммунного СД, наиболее типичного Th1-заболевания.

Данные относительно содержания этого цитокина в периферической крови пациентов с СД типа 1 и их сиб-сов, базальной и стимулированной фитогеммагглютини-ном (ФГА) продукции мононуклеарами in vitro крайне противоречивы. Одни авторы обнаруживали более низкий его уровень [1, 11], другие не находили отличия от контрольной группы [10, 13, 14], третьи отмечали даже его повышение в дебюте СД типа 1 [19].

При исследовании базальной продукции IL-4 отмечалась отчетливая тенденция к более высоким уровням в группе LADA (80,61±36,04 пг/мл), чем в группе пациентов, страдающих СД типа 2 (52,45±23,27 пг/мл), и наименьшим в группе больных СД типа 1 (29,11±18,52 пг/ мл). Однако уровень статистической значимости не был достигнут из-за малого объема выборок (р СД типа 1– СД типа 2=0,56; р СД типа 1 – LADA=0,2; р СД типа 2 – LADA=0,56). Выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость между уровнем базальной продукции IL-4 и весом при СД (r=–0,34, p < 0,05). При СД типа 2 – прямая связь с весом (r=0,48, p=0,03), и обратная связь со стажем инсулинотерапии (r=–0,5, p=0,02).

При исследовании ФГА-стимулированной продукции IL-4 отмечалась отчетливая тенденция к более высоким уровням в группе LADA (29,86±13,62 пг/мл), затем в группе пациентов, страдающих СД типа 2 (11,09±7,96 пг/мл), и наименьшим в группе больных СД типа 1 (3,36±2,36 пг/мл). Причем, различие средней ФГА-стимулированной продукции IL-4 в группах LADA и СД типа 1 было статистически значимым, несмотря на малый объем выборок (р СД типа 1 – LADA=0,047; р СД типа 1 – СД типа 2=0,56; р СД типа 2 – LADA=0,27). Полученные результаты также отражают истощение функциональных резервов моно-нуклеаров при аутоиммунном процессе (табл. 1). Выявлена статистически значимая прямая корреляционная зависимость между уровнем ФГА-стимулированной продукции IL-4 и стажем инсулинотерапии при LADA (r=0,99, p=0,001) и при СД типа 1 (r=0,97, p=0,00007). При СД типа 2 – со стажем диабета (r=0,98, p < 0,0001) и стажем инсулинотерапии (r=0,69, p=0,0005). Более высокий уровень базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-4 при LADA вероятно отражает патогенетические особенности функционирования Т-звена иммунитета, отличные от механизмов развития СД типа 1, определяющие более медленное повреждение β -клеток при этом заболевании. Низкий уровень базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-4 при СД типа 1 свидетельствует в пользу Th-1 поляризации иммунного ответа.

Заключение

Для пациентов с СД типа 1 характерен высокий уровень базальной продукции IL-2 и низкий уровень базальной продукции IL-4, что согласуется с гипотезой о Th1-поляризации иммунного ответа при этом заболевании. Низкие уровни ФГА-стимулированной продукции как IL-2, так и IL-4, вероятно, свидетельствуют в пользу функционального истощения мононуклеаров вследствие аутоиммунного процесса, хронической гипергликемии и инсулиновой недостаточности.

В группе больных LADA также отмечен относительно высокий уровень базальной продукции IL-2, что может рассматриваться как проявление аутоиммунного процесса. Низкий уровень ФГА-стимулированной продукции IL-2 также говорит о функциональном истощении мононук-леаров. Интересен тот факт, что уровни базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-4 при LADA значимо выше, чем остальных группах. Это вероятно отражает патогенетические особенности функционирования Т звена иммунитета при LADA, отличные от механизмов развития СД типа 1, определяющие более медленное повреждение β -клеток при этом заболевании.

Все вышеизложенное, на наш взгляд, не только подтверждает важную роль поляризации иммунного ответа в патогенезе аутоиммунного диабета, но и ставит вопрос о значении цитокиновой регуляции в механизмах формирования LADA, т.е. о детерминации скорости деструкции β -клеток при естественном течении заболевания. Дальнейшее расширение знаний в этой области, верификация и детализация участия иммунопатологических процессов в прогрессировании деструкции β -клеток поджелудочной железы при СД типа 1 даст возможность разработать новые диагностические и терапевтические подходы в отношении этого заболевания.