Особенности динамики острофазных белков в условиях репаративной регенерации

Материалы и методы. Исследования были проведены на 40 кроликах обоего пола в возрасте 6-10 месяцев с массой тела 2526,5±74,4 г. Эксперименты были одобрены Локальным Этическим Комитетом при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального    образования    «Казанский    государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской

Федерации (протокол №5 от 25 июня 2013г.).

Всем животным под общим потенцированным обезболиванием проводили открытую остеоклазию большой берцовой кости в области средней и нижней трети диафиза c последующим ретроградным введением имплантата в костномозговой канал. В группе сравнения (20 животных) вводились спицы из стали 12Х18H9Т, d×2 мм, в опытной группе (20 животных) – спицы из стали 12Х18H9Т с биоинертным покрытием нитридами титана и гафния, d×2 мм. Для покрытия использован способ ионно-плазменного нанесения с электроннодуговым испарением (КИБ). Поскольку толщина покрытия в пределах 10-3 mμ, то оно может быть отнесено к разряду нанопокрытий.

Взятие крови осуществляли венепункцией до операции, на 1-е, 5-е 10-е, 20-е, 30-е, 60-е, 180-е сутки после оперативного вмешательства. Применяли вакуумные пробирки IMPROVE с гелем-активатором свертывания крови. Разделение белков сыворотки крови проводилось методом электрофоеза на ацетатцеллюлозе, с использованием вероналового буферного раствора pH 8,6. Обработку полученных данных производили с использованием программы Image Master 1D Gel Analysis v3.0.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением пакета программ «SPSS» версия 13. Для наглядности использовали построение графических диаграмм статистических величин. Вычисляли среднеарифметическое выборочное значение показателя (М), стандартную ошибку среднеарифметического значения (m) по каждой из сравниваемых величин с определением достоверности различий (p) по методу Стьюдента – Фишера.

Результаты и их обсуждение. Уровень общего белка сыворотки в ходе эксперимента в обеих группах животных не выходил за пределы видовой физиологической нормы для кроликов (54-75 г/л) (табл. 1).

Таблица 1 - Содержание общего белка (г/л).

Группа животных	до операции	5 сутки	10 сутки	20 сутки	30 сутки	60 сутки	180 сутки
сравнения	63,34 ± 0,94	50,68 ± 5,03	64,51 ± 1,99	65,59 ± 2,08	63,95 ± 2,09	66,23 ± 1,88	70,29 ± 3,64
опытная	57,12 ± 0,79	56,20 ± 1,04	61,74 ± 1,30	60,21 ± 1,75	61,27 ± 1,09	58,84 ± 0,68	68,80 ± 4,13

Выявлено достоверное снижение содержания альбумина (норма для кроликов 23,65–38,35) у животных обеих групп на пятые сутки после оперативного вмешательства (группа сравнения р=0,001; опытная группа р=0,012). Более выражено оно в группе сравнения (р=0,002). К 10 суткам у животных опытной группы значения возвращались к таковым до операции, а у животных группы сравнения это происходило лишь к 30 суткам (табл. 2).

Таблица 2 - Содержание альбумина (г/л).

Группа животных	До операции	5 сутки	10 сутки	20 сутки	30 сутки	60 сутки	180 сутки
сравнения	43,02 ± 0,61~~~	23,77 ± 1,46	36,56 ± 0,90~~~	35,50 ± 0,79~~~	39,26 ± 1,22~~~	40,56 ±0,60~~~	39,35 ± 3,12~~~
опытная	38,87 ± 0,75~	31,34 ± 0,88	37,79 ± 0,94	35,44 ± 2,67	39,92 ± 1,24~~	39,27 ± 1,06~~	41,59 ± 1,12~~~

~- достоверные различия с показателями 5-х суток ~р0,05 ~~р< 0,01 ~~~р< 0,001

На пятые сутки после операции наблюдалось достоверное повышение содержания α – глобулинов (норма 3,44-7,08) у животных обеих групп, причем в группе сравнения (р=0,001) оно было более выражено. У животных опытной группы уровень α – глобулинов достоверно снижался к 20 суткам, а в группе сравнения – лишь к 30. В состав α – глобулиновой фракции входят такие реактанты острой фазы, как ингибиторы протеаз α 1 антитрипсин, α 1 -антитрипсин, α 2 макроглобулин; антиоксиданты – церулоплазмин и гаптоглобин. Каждый из них участвует в ограничении процессов вторичной альтерации на участке повреждения и повышение их уровня свидетельствует о реализации защитного ответа организма, который в наших экспериментах оказался продолжительнее в группе сравнения (табл. 3).

Таблица 3 - Содержание α глобулинов (г/л)

Группа животных	до операции	5 сутки	10 сутки	20 сутки	30 сутки	60 сутки	180 сутки
контроль	4,42 ±	9,19 ±	6,84 ±	6,94 ±	5,51 ±	5,81 ±	4,81 ±
ная	0,17~~~	1,09	0,86	0,47	0,47~	0,56~	0,01~
	3,95 ±	7,34 ±	6,49 ±	5,05 ±	4,93 ±	4,49 ±	5,30 ±
опытная	0,30~~~	0,28	0,61^	0,18~~	0,15~~	0,24~~~	0,65~

~- достоверные различия с показателями 5-х суток ~р0,05 ~~р< 0,01 ~~~р < 0,001 ^- достоверные различия с показателями 60-х суток ^р0,05

Фракция β глобулинов имеет два пика - β 1, содержащий преимущественно трансферрин, и β 2 , в состав которого входят β липопротеиды, IgA, IgM, иногда IgG и белки комплемента.

В наших экспериментах мы не наблюдали статистически значимого изменения уровня β1 глобулинов. Отмечалась лишь тенденция к повышению этой фракции на протяжении всего опыта у животных обеих групп по сравнению со значениями до операции (табл. 4).

Таблица 4 - Содержание β 1 глобулинов (г/л)

группы животных	до операции	5 сутки	10 сутки	20 сутки	30 сутки	60 сутки	180 сутки
контроль	5,68 ±	6,60 ±	8,50 ±	8,72 ±	7,26 ±	7,62 ±	7,46 ±
ная	0,60	1,04	0,61	1,03	0,46	0,84	0,12
	5,27 ±	6,30 ±	7,60 ±	7,44 ±	7,07 ±	6,23 ±	6,44 ±
опытная	0,21	0,34	0,61	0,59	0,55	0,33	0,67

Что касается фракции β₂ глобулинов, то их уровень повышался на 5 сутки у животных обеих групп, в опытной группе рост был достоверным (р=0,044) и значения вернулись к дооперационным показателям к 60 суткам (р=0,019). В группе сравнения также была тенденция к повышению β 2 фракции, но статистически не значимая.

Характерно, что мы также наблюдали вторую волну подъема уровня β 2 глобулинов к 180 суткам (р=0,01) в обеих группах животных и вновь она была статистически значима в опытной группе (Табл. 5). Этот факт, на наш взгляд, следует рассматривать в связи с динамикой фракции γ – глобулинов, поскольку, как указывалось, β 2 глобулины содержат в своем составе IgA, IgM, а также, частично IgG.

Таблица 5 - Содержание β2 глобулинов (г/л)

группы животных	до операции	5 сутки	10 сутки	20 сутки	30 сутки	60 сутки	180 сутки
контроль	2,48 ±	3,49 ±	3,09 ±	3,12 ±	2,49 ±	2,02 ±	3,10 ±
ная	0,13	0,47	0,33	0,23	0,23	0,16~	0,14
	1,91 ±	3,64 ±	3,01 ±	2,46 ±	2,23 ±	1,87 ±	3,98 ±
опытная	0,11~	0,39	0,28	0,26	0,24>	0,25~	0,72

~- достоверные различия с показателями 5-х суток ~р0,05

>- достоверные различия с показателями 180-х суток >р0,05

Таблица 6.- Содержание γ – глобулинов (г/л).

группы животных	до операции	5 сутки	10 сутки	20 сутки	30 сутки	60 сутки	180 сутки
контроль	7,61 ±	7,59 ±	9,52 ±	10,83 ±	8,91 ±	9,84 ±	15,57 ±
ная	0,30	1,46	0,54	0,61	0,48+	0,64	0,55***
	6,96 ±	7,27 ±	6,85 ±	9,77 ±	7,12 ±	6,96 ±	11,49 ±
опытная	0,33	0,26	0,53	1,12	0,39	0,68	1,58*

*- достоверные различия с дооперационными значениями *p0,05 **р0,01 ***р0,001

Уровень γ – глобулинов (норма для кроликов 7,31 – 13,57) достоверно повышается к 180 суткам в обеих группах (контрольная группа р=0,0001; опытная группа р=0,012) (табл. 6). Подъем был более выражен в группе сравнения, значимое различие между животными разных групп наблюдалось на 10-е (р=0,008), 30-е (р=0,02) и 60-е сутки (р=0,015). Фракция γ – глобулинов содержит преимущественно IgG и её повышение отражает мобилизацию специфических иммунных защитных механизмов.

Заключение. Таким образом, на фоне неизменного уровня общего белка, после перенесенной травмы и развития процесса регенерации, мы наблюдали характерную для ответа острой фазы диспротеинемию – изменение соотношения белковых фракций крови. Выявлено две «волны» реакции. Первая развивалась к 5-м суткам и характеризовалась снижением уровня альбуминов и повышением α- и β₂-глобулинов, эта реакция затухала в опытной группе раньше, чем в группе сравнения; вторая – достигала максимума к 180-м суткам и характеризовалась повышением β_2-и γ- глобулинов. Наблюдаемые сдвиги соответствуют фазам раннего неспецифического ответа, включающего повышенный синтез положительных и пониженный синтез отрицательных РОФ печенью под влиянием цитокинов, и более позднему специфическому адаптивному иммунному ответу. В целом, интенсивность реакций в опытной группе была меньше, чем в группе сравнения, что свидетельствует о менее выраженном повреждающем стимуле при использовании имплантатов с покрытием нитридами титана и гафния.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Сахно Н.В., Тимофеев С.В., Черванев В.А. и др. Лечение переломов трубчатых костей у животных: Учебное пособие/Под ред. Н.В. Сахно. – СПб.: Издательство «Лань», 2007. – 192 с. 2. Sovak G., Weiss A., Gotman I. Osseointegration of Ti6Al4V alloy implants coated with titanium nitride by a new method//British editional society of bone and joint surgery, 2000,№2,Р.290-296. 3. Шевцов В.И. и др. Возрастные изменения массы мышечной, соединительной и жировой тканей у здоровых людей//Гений ортопедии, 2005, № 1, с. 58-66. 4. Немченко Н.С., Ерюхин И.А., Шанин В.Ю. Постагрессионный обмен веществ при тяжелой механической травме//Вестник хирургии, 1991, №4, с. 53-57. 5. Plecko M., Sievert C., Andermatt D. et al. Osseointegration and biocompatibility of different metal implants - a comparative experimental investigation in sheep// BMC Musculoskeletal Disorders 2012, The electronic version of this article is the complete one and can be found online at: http://www.biomedcentral.com/1471-2474/13/32. 6. Ефремов А.П., Мартынов П.Н. Интерьерные различия крольчат разного возраста//Биологические науки. Фундаментальные исследования, 2012, №5, с. 138-142. 7. Зилва Дж.Ф., Пэннелл П.Р., Березов Т.Т. Клиническая химия в диагностике и лечении// М.: Медицина. – 1988. – 528 с.

ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ ОСТРОФАЗНЫХ БЕЛКОВ В УСЛОВИЯХ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ

Бакланова Д.А

Резюме

Динамика изменений содержания белковых фракций была изучена при экспериментальном интрамедуллярном остеосинтезе фиксаторами покрытыми нитридами титана и гафния у кроликов. Белковые фракции сыворотки крови определялись до оперативного вмешательства и после на сроках от 5 до 180 суток. При неизменном уровне общего белка, после перенесенной травмы и развитии процесса остеорегенерации, наблюдалось характерная для ответной воспалительной реакции изменение белкового спектра крови. Выявленные изменения характеризовались двумя «волнами» реакции организма. Первая развивалась к 5-м суткам и характеризовалась снижением уровня альбуминов и повышением α – и β 2 – глобулинов, затухание этой реакции в опытной группе происходило в более ранние сроки, чем в группе сравнения; вторая – достигала максимума к 180-м суткам и включала повышение β 2 – и γ – глобулинов. Данные изменения соответствуют фазам раннего неспецифического ответа, включающего повышенный синтез положительных и пониженный отрицательных РОФ печенью под влиянием цитокинов, и более позднему специфическому адаптивному иммунному ответу. Меньшая выраженность интенсивность реакций в опытной группе в отличие от группы сравнения свидетельствует о менее выраженном повреждающем воздействии имплантатов с покрытием нитридами титана и гафния.

EVALUATION OF ACUTE-PHASE PROTEINS IN THE CONDITIONS OF REPARATIVE REGENERATION

Baklanova D.A.