Особенности функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови у коров, реагирующих на ППД-туберкулин, и больных туберкулезом

Важным показателем неспецифической резистентности организма является функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов, ответственных за процесс фагоцитоза в очаге воспаления и нейтрализацию инфекционных агентов. При поглощении и переваривании чужеродных частиц фагоцитирующими клетками периферической крови происходит резкое возрастание потребления кислорода. Все эти процессы настолько интенсивны, что получили название метаболического (респираторного, дыхательного) взрыва [1].

Туберкулез, как и другие инфекционно-воспалительные процессы, не оставляет безучастными различные звенья неспецифической резистентности организма. Но, несмотря на то, что в настоящее время уже сложилось обобщенное представление об иммунофагоцитарной системе периферической крови, процесс неспецифической резистентности при туберкулезе остается до конца неизученным [2].

В связи с вышесказанным предметом нашего исследовательского интереса стало изучение особенностей функционально-метаболического статуса нейтрофилов у крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин, и больного туберкулезом.

Материалы    и    методы    исследований.    Состояние кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови и их функциональную активность оценивали методом спонтанной и стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) с помощью 36-канального автоматизированного хемилюминометра СL3604 [3], а также в тесте с нитросинимтетразолием (НСТ): спонтанном и стимулированном БЦЖ вариантах с последующей фиксацией реакции с помощью многоканального иммунохимического анализатора «Fluorofot STDLess – 486-М». Оценку концентрации образовавшегося диформазана в нейтрофилах определяли по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм с последующим подсчетом коэффициента стимуляции (К ст.). К ст.=оптическая плотность в стимулированных лунках / оптическая плотность в контрольных лунках [4].

Материалом для бактериологического исследования служили заглоточные и средостенные лимфатические узлы и кусочки паренхиматозных органов от крупного рогатого скота, положительно реагирующего на ППД-туберкулин для млекопитающих. После проведения предпосевной обработки суспензии биоматериала высевали на питательные среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л. Идентификацию выделенных культур проводили культуральными и биохимическими методами в соответствии с Наставлением по диагностике туберкулеза животных (2002 г.). Одновременно суспензиями биоматериалов были заражены морские свинки для постановки биологической пробы [5].

Первоначально провели сравнительное испытание показателей метаболической активности нейтрофилов периферической крови. Для этого отобрали 20 животных, которых разделили на 3 группы: 1-ю группу составили 5 голов, нереагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, из благополучного хозяйства (контроль), 2-ю группу – 7 животных, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, из благополучного по туберкулезу хозяйства и 3-ю – 8 голов, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, из неблагополучного по туберкулезу хозяйства. При бактериологическом исследовании биоматериала от коров 2-ой группы выделены атипичные микобактерии III-IV групп по Раньону и 3-й группы – культура M. bovis.

На следующем этапе с целью выявления сочетаний показателей функционально-метаболической активности клеток крови, указывающих на уровень противотуберкулезного иммунитета, иммунологические параметры всех 20-и коров были подвергнуты исследованию дискретнодинамическим анализом с последующим составлением прогностической таблицы. Помимо этого для установления более объективной картины в различии взаимосвязей между иммунологическими параметрами у экспериментальных животных в периферической крови определили содержание иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании (тыс/мкл): число Т-лимфоцитов с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-рок), Т-киллеров – непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка и В-лимфоцитов – комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка [6]. Подсчет лейкоцитов и выведение лейкоцитарной формулы проводили по общепринятым методикам.

Математическая обработка цифровых данных включала определение средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m). Для оценки существенности различий между двумя средними величинами М х и М у использовали t-критерий по Стьюденту. Различие между контролем и опытом считалось статистически достоверным только для Р≤0,05.

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты исследования функционально-метаболического статуса у коров разных групп представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Средние значения показателей функциональнометаболической активности нейтрофилов

Группа животных	Символы статистики	ХЛ-метод, имп/мин		НСТ-тест, у.е. оп. пл.		К ст. НСТ
		спонт.	стимулир.	спонт.	стимулир
1-я группа	M	1162,60	1168,6	60,60	104,60	1,71
(контроль)	m±	12,41	13,00	4,45	11,87	0,12
	M	1173,28	1290,71	34,00	33,43	1,04
2-я группа	m±	28,02	71,58	3,57	2,85	0,12
	Р	>0,05	>0,05	<0,01	<0,001	<0,01
	M	1593,87	1633,00	71,12	28,75	0,50
3-я группа	m±	181,24	189,27	13,83	8,30	0,13
	Р	<0,05	<0,05	>0,05	<0,001	<0,001

Значения спонтанной и стимулированной люминолзависимой ХЛ клеток крови у реагирующих на ППД-туберкулин животных не отличались от таковых у здоровых, тогда как у больных туберкулезом коров с высокой степенью достоверности (Р<0,05) увеличивались (соответственно: 1593,87±181,24 и 1162,60±12,41 имп/мин в спонтанном варианте; 1633,00±189,27 и 1168,60±13,00 имп/мин в индуцированном варианте).

Спонтанный уровень генерации кислородных радикалов в нейтрофильных гранулоцитах в НСТ-тесте у реагирующих на ППД-туберкулин и больных туберкулезом также был изменен, но если у первых он был резко снижен (соответственно: 34,00±3,57 и 60,60±4,45 у. е. оп. пл.; Р<0,01), то у последних – увеличен.

Уровень функциональной активности нейтрофилов в НСТ-тесте, стимулированном БЦЖ, был резко сниженным как у реагирующих на ППД-туберкулин, так и больных туберкулезом коров.

Центральным признаком, свидетельствующим о снижении резистентности организма и низкой микробицидной активности нейтрофилов, являлось снижение показателей стимулированной реакции НСТ по отношению к спонтанной (коэффициента стимуляции – К ст.). Так, если у здоровых коров К ст. в среднем составил 1,71±0,12, то у 100 % больных туберкулезом животных этот коэффициент снизился (0,50±0,13).

У коров, реагирующих на ППД-туберкулин, отклонения показателей НСТ-теста не во всех случаях были однонаправленными: повышенным значениям спонтанного НСТ могли сопутствовать сниженные значения стимулированного НСТ и наоборот.

Поскольку в основе функционирования любой системы лежат связи между ее компонентами, для изучения иммунной системы у животных на следующем этапе был применен дискретно-динамический подход, базирующийся на оценке системы с позиции взаимосвязей между параметрами. С этой целью всех исследуемых животных разделили на подгруппы с минимальными и максимальными значениями параметров с установкой стабильности границ базиса, а затем провели статистическую обработку цифрового материала в подгруппах, отобрали значимые сочетания параметров по t-критерию Стьюдента и построили дифференциально-прогностическую таблицу. Таблицу составляли на основании выбора тех интервалов значений сочетаний параметров, которые различались в группе здоровых и больных туберкулезом животных.

В таблице 2 представлено 11 пар таких сочетаний. Обращает на себя внимание, что из большого количества возможных сочетаний прогностически значимыми оказались именно те, которые характеризуют функционально-метаболическую активность нейтрофилов: коэффициент стимуляции НСТ (К ст.НСТ), уровень спонтанной и стимулированной ХЛ (ХЛ спонт. ,ХЛ стим. ) и НСТ-тест, индуцированный БЦЖ (НСТ БЦЖ ). Все это свидетельствует о важной роли показателей метаболической активности нейтрофилов в развитии противотуберкулезного иммунитета.

Таблица 2 - Дифференциально-прогностическая таблица по оценке иммунного статуса у крупного рогатого скота

№ п/п	Сочетание: базис (вариабельный параметр)	n	t-критерий по Стьюденту	базис	вариабельный
1	ХЛ стим. (К ст. НСТ)	20	4,90	≤1180	≥0,17
2	К ст. НСТ (НСТ БЦЖ )		3,99	≥1,46	≥82
3	НСТ БЦЖ (К ст. НСТ)		3,97	≥71	≥0,64
4	ХЛ спонт. (К ст. НСТ)		3,93	≤1170	≥0,82
5	Т-киллеры (НСТ БЦЖ )		3,22	≤0,88	≥34
6	В-лимфоциты (К ст. НСТ)		2,95	≤0,60	≥0,15
7	Т-киллеры (НСТ спонт. )		2,91	≤0,88	≥21
8	ХЛ стим. (В-лимфоциты)		2,52	≤1180	≤0,75
9	ХЛ спонт. (ХЛ стим. )		2,51	≤1170	≤1167
10	ХЛ стим. (ХЛ спонт. )		2,37	≤1180	≤1172
11	ХЛ стим. (НСТ БЦЖ )		2,36	≤1180	≥18
Количество животных с высокой активностью иммунокомпетентных клеток		7	35 %

В результате изучения взаимосвязей выбраны интервалы значений параметров в их сочетаниях, по соответствию которых индивидуальным показателям отдельно взятого животного были установлены особи с высокой активностью иммунокомпетентных клеток. В результате выявлено 7 коров (35 %) с высокой активностью иммунокомпетентных клеток, в том числе 5 контрольных и 2 реагирующих на ППД-туберкулин из благополучного по туберкулезу хозяйства. Иммунная система животных, инфицированных M. bovis, находится в состоянии функционального напряжения, о чем свидетельствует отсутствие животных с высокой активностью иммунокомпетентных клеток.

Выводы: 1. Особенностью кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных туберкулезом животных является увеличение их свечения как при взаимодействии со специфическим антигеном, так и без него. В то же время данные бактериологических исследований наряду с ХЛ исследованиями подтвердили неспецифическую природу аллергических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота из благополучного по туберкулезу хозяйства.

• 2.    Повышение в НСТ-тесте у больных туберкулезом спонтанного уровня генерации кислородных радикалов в нейтрофильных гранулоцитах можно расценивать как защитно-приспособительный механизм возмещения дефекта бактерицидной функции клеток. Низкие значения коэффициента стимуляции НСТ, определяемого как соотношение между индуцированным и спонтанным вариантом, являются центральным признаком, отражающим истощение противоинфекционного потенциала нейтрофилов у инфицированных животных.

• 3.    С помощью дифференциально-прогностической таблицы, составленной на основании дискретно-динамического анализа, определены сочетания показателей активности клеток крови, позволяющих прогнозировать развитие заболевания. Изучение иммунной системы на основе взаимосвязей подтвердило важную роль показателей метаболической активности нейтрофилов в формировании противотуберкулезного иммунитета.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Лебедев К.А. Иммунная недостаточность (выявление и лечение) / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина. – М: Медицинская книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003. – 443 с. 2. Филинюк О. В. Цитохимическая и микробицидная активность фагоцитов крови у больных туберкулезом легких / О. В. Филинюк, Н. А. Земляная, А. К. Стрелис и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2007. – № 1. – С. 62-66. 3. Пат. 2296334 РФ, МПК7 G01N 33/569. Способ прижизненной диагностики туберкулеза / Г.М. Дюсенова, В.Г. Ощепков; заявитель и патентообладатель Всероссийский науч.- исслед. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных. – №2004124989/15; заявл. 16.08.04; опубл. 27.03.07,

Бюл. №9. 4. Пат. 2218567 РФ, МПК7G 01 N 33/52. Способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека / М.А. Годков, В.Ю. Зинкин.; заявитель и патентообладатель науч.- исслед. ин-т скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. – №2001132646/14; заявл. 05.12.01; опубл. 10.12.03. 5. Наставление по диагностике туберкулеза животных. – М., 2002,утверждено ДВ МСХ РФ 18.11.2002. 6. Бажин М.А. Дискретнодинамический анализ в оценке иммунитета / М.А. Бажин, В.С. Власенко, А.Н. Новиков, Ю.И. Пацула // Методические рекомендации / СО РАСХН. ВНИИБТЖ. – Омск, 2005. – 24 с.

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У КОРОВ, РЕАГИРУЮЩИХ НА ППД-ТУБЕРКУЛИН, И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ

Власенко В.С., Бажин М.А., Дюсенова Г.М., Таллер Л.А.

Резюме

В статье представлены результаты оценки метаболического взрыва на основании определения активных форм кислорода в нейтрофиле (хемилюминесценция (ХЛ), тест восстановления нитросинего тeтразолия (НСТ)) у здоровых, инфицированных атипичными микобактериями и больных туберкулезом коров. Установлено, что функциональнометаболический статус больных туберкулезом характеризуется увеличением значений люминолзависимой ХЛ клеток крови, а также истощением противомикробного потенциала нейтрофилов, о чем свидетельствовали низкие показатели коэффициента стимуляции НСТ у 100 % инфицированных M. bovis животных.

THE FEATURES OF FUNCTIONAL METABOLIC ACTIVITY PERIPHERAL

BLOOD OF NEUTROPHILS IN COWS REACTING TO PPD-TUBERCULIN AND TB PATIENTS

Vlasenko V.S., Bazhin M.A., Dyusenova G.M., Taller L.A.