Особенности токсического действия диизононилфталата и его регламентирование в полимерных материалах и изделиях медицинского назначения

Грынчак Виталий Александрович ‒ кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник лаборатории профилактической и экологической токсикологии (e-mail: ; тел.: 8 (017) 284-13-82; ORCID: .

Сычик Сергей Иванович ‒ кандидат медицинских наук, доцент, директор (e-mail: ; тел.: 8 (017) 284-03-87; ORCID: .

мому воздействию подвергается внутренняя среда организма пациента1 [4‒7].

На протяжении многих лет в производстве полимерных изделий использовались низкомолекулярные ФП, среди которых основными являлись диоктилфталат (ДОФ) и дибутилфталат (ДБФ), обладающие высокой миграционной способностью [8, 9]. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что указанные фталаты при длительном воздействии вызывают выраженные токсические эффекты, поражая преимущественно репродуктивную и эндокринную системы [10‒14]. В подходах к регулированию применения фталатов имеются национальные отличия, в том числе использование оценки риска здоровью, установление допустимых уровней миграции из изделий; при этом в ряде стран введен запрет и/или ограничение использования ДОФ и ДБФ.

Поиск альтернативных ФП с улучшенными технологическими характеристиками и низкой миграционной способностью привел к широкому использованию новых высокомолекулярных пластификаторов, среди которых особое место занимает диизононилфталат (ДИНФ), имеющий два изомера (CAS № 68515-48-0 и № 28553-12-0). Анализ литературных данных показывает, что изомер ДИНФ CAS № 28553-12-0, обладающий более разветвленной углеродной цепью и наиболее широко используемый в настоящее время в производстве ПВХ и изделий из него, не имеет полной токсикологической характеристики, не изучены закономерности его дозозависимого токсического и специфического действия на организм при длительной экспозиции, в том числе на эндокринную и репродуктивную системы, не обоснован безопасный уровень миграции из изделий медицинского назначения.

Цель исследования ‒ установить особенности и закономерности токсического действия диизононилфталата на организм экспериментальных животных и научно обосновать регламент допустимого количества его миграции из полимерных материалов и изделий медицинского назначения.

Материалы и методы. Эксперименты проведены на основании методических документов2 на трех видах лабораторных животных: 106 белых мышах массой от 18 до 22 г, 352 рандомбредных белых крысах массой от 180 до 210 г и пяти белых кроликах массой от 4,2 до 4,5 кг.

В острых опытах параметры токсикометрии ДИНФ определяли при внутрижелудочном, внутрибрюшинном, эпикутанном и ингаляционном путях поступления в организм экспериментальных животных. Способность к кумуляции в субхроническом опыте изучали на белых крысах при введении в желудок ДИНФ в дозах от 100,0 до 10 000,0 мг/кг в течение 60 дней. В хроническом эксперименте продолжительностью шесть месяцев ДИНФ вводили внутрижелудочно белым крысам в диапазоне доз от 0,01 до 1000,0 мг/кг.

Исследования выполнены согласно Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или в иных научных целях (ETS № 123) и Правилам лабораторной практики (GLP). Лабораторных животных выводили из экспериментов, соблюдая требования Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1997).

Влияние ДИНФ на репродуктивную функцию проводили по методу, предложенному А.А. Динер-ман [15]. При помощи метода сагиттальных срезов, предложенного W. Wilson в модификации А.П. Дыбан [16], изучали наличие аномалий развития внутренних органов эмбрионов белых крыс. Установление раздражающего действия на неповрежденные кожные покровы и слизистые оболочки глаза, сенсибилизирующее действие проведено в соответствии с инструкцией № 1.1.11‒12‒35‒2004. Для оценки мутагенной активности использовали тест Эймса [17]. Метафазный анализ аберраций хромосом в клетках костного мозга и селезенки изучен на мышах3. Состояние генетических структур лейкоцитов белых крыс исследовали в субхроническом и хроническом опытах в мазках, приготовленных по методу J.N. Mills [18]. Изучение органолептических и санитарнохимических показателей для определения лимитирующего признака вредности проведено в соответствии с инструкцией4.

Статистическая обработка полученных данных проведена общепринятыми методами анализа с ис- пользованием компьютерных программ MS Excel, Statistica 10. Статистически значимыми различия между контрольными и опытными группами считались при р < 0,05.

Полученные экспериментальные данные о токсических свойствах ДИНФ могут использоваться при установлении параметров безопасности по критериям допустимого риска для здоровья.

Результаты и их обсуждение. В острых опытах при внутрижелудочном введении ДИНФ подопытным животным обоего пола в максимально возможных по объему введения дозах симптомы интоксикации и летальные исходы не зарегистрированы. Аналогичные результаты получены при внутрибрюшинном введении и нанесении ДИНФ на кожу. Потенциальная ингаляционная опасность развития острого отравления из-за низкой летучести соединения в опытах на мышах не установлена. Отсутствие смертельных эффектов в указанных сериях опытов не позволило рассчитать среднесмертельные дозы и концентрации (таблица).

Параметры острой токсичности ДИНФ

Показатель	Вид животных	Величина, мг/кг	Классификационная оценка
Средняя смертельная доза при введении в желудок	Крысы	> 5000,0	IV класс опасности, вещества малоопасные5
	Мыши
Средняя смертельная доза при нанесении на кожу	Крысы	>2500,0
Средняя смертельная доза при внутрибрюшинном введении	Крысы	>3000,0	VI класс токсичности, вещества относительно безвредные [19]
	Мыши

При однократном эпикутанном воздействии ДИНФ на неповрежденные кожные покровы и слизистые оболочки глаза лабораторных животных раздражающее действие не выявлено. В опытах на модели воспроизведения и выявления гиперчувствительности замедленного типа у белых мышей сенсибилизирующее действие ДИНФ не обнаружено.

При повторном двухмесячном внутрижелу-дочном введении белым крысам в дозах 10 000,0, 1000,0 и 100,0 мг/кг ДИНФ не проявлял кумулятивные свойства на уровне смертельных эффектов, но оказывал общетоксическое действие политропного характера. Нарушение состояния нервной системы проявилось изменением у опытных животных двигательной активности в виде снижения показателя «Проход по секторам» при введении дозы 10 000,0 мг/кг в 2,9 раза и возрастанию его при дозе 100,0 мг/кг в 1,8 раза, p < 0,05. Анализ показателей периферической крови опытных крыс при воздействии дозы 10 000,0 мг/кг выявил признаки железодефи- цитной анемии: эритропению, снижение гематокрита, объема эритроцитов, содержания и концентрации гемоглобина в эритроците, которые сопровождались статистически значимым снижением содержания сывороточного железа в 3,0 раза при максимальной дозе и 2,4 раза при десятикратном ее снижении по сравнению с животными контрольной группы.

Нарушения минерального обмена в субхроническом эксперименте при введении ДИНФ крысам в дозах 10 000,0 и 1000,0 мг/кг проявлялись снижением содержания кальция сыворотки крови в 1,2–1,4 раза ( p < 0,05) за счет усиленной его экскреции с мочой в 5,2‒8,6 раза ( p < 0,05) по сравнению с контролем. Противоположная картина отмечалась в содержании фосфора ‒ рост уровня в крови на 30,6‒33,3 % ( p < 0,05) при снижении его выведения с мочой в 2,3‒9,1 раза при сравнении с контрольными животными ( p < 0,05); это относилось ко всем испытанным дозам.

На нарушение функционального состояния почек при повторном введении ДИНФ в диапазоне испытуемых доз указывают статистически значимое увеличение у опытных крыс диуреза в 1,9‒3,9 раза и снижение содержания мочевой кислоты в 2,5‒4,2 раза, мочевины – в 1,5‒2,1 раза, креатинина – в 2,0‒3,1 раза по отношению к контролю. При воздействии ДИНФ на уровне 10 000,0 мг/кг установлено у опытных животных уменьшение ОКМ почек в 1,2 раза ( p < 0,05) и усиление экскреции магния с мочой в 1,7 раза ( p < 0,05) по сравнению с контролем. Указанные изменения сопровождались структурными нарушениями почек в виде дистрофических и воспалительных процессов.

При статистической обработке результатов анализа ферментативной активности сыворотки крови белых крыс при введении изученных доз ДИНФ выявлено увеличение уровня гамма-глютамилтранспеп-тидазы на 12,5‒17,6 % ( p < 0,05), снижение аспарагиновой аминотрансферазы в 1,5 раза и повышение а -амилазы в 1,4 раза по сравнению с контрольной группой при p < 0,05.

При проведении морфологических исследований печени у опытных крыс обнаружены дистрофические изменения гепатоцитов, признаки межуточного гепатита и увеличение относительного коэффициента массы (ОКМ) органа в 1,2‒1,6 раза ( p < 0,05) при дозах ДИНФ 10 000,0 и 1000,0 мг/кг. Со стороны селезенки наблюдалась гиперплазия лимфоидных фолликулов белой пульпы, полнокровие и реактивная пролиферация красной пульпы на фоне увеличения ОКМ органа в 1,4 раза ( p < 0,05) по отношению к контролю. Морфологически выявлены у опытных крыс также признаки гастрита и интерстициального панкреатита.

Анализ показателей гормонального статуса опытных животных при субхроническом пероральном воздействии ДИНФ в диапазоне доз от 10 000,0 до 100,0 мг/кг не выявил статистически значимых изменений. Однако при проведении морфологических и морфометрических исследований у них обнаружено дозозависимое снижение диаметра фолликулов щитовидной железы в 1,3‒2,3 раза (p < 0,05) с признаками развития диффузного токсического зоба, гиперплазия коркового вещества надпочечников с увеличением толщины коры в 1,3‒1,8 раза при p < 0,05.

Цитогенетический анализ периферической крови опытных крыс после завершения субхронического эксперимента выявил увеличение количества лейкоцитов с морфологическими признаками некротической гибели, которое в 5,1‒6,1 раза превышало контрольные показатели ( p < 0,05) при воздействующих дозах ДИНФ на уровне 10 000,0 и 1000,0 мг/кг.

На протяжении 180-дневного опыта на белых крысах (одна контрольная и шесть опытных групп) при внутрижелудочном введении ДИНФ в дозах от 0,01 до 1000,0 мг/кг внешние признаки интоксикации и поведенческие нарушения отсутствовали. По окончании эксперимента выявлены проявления токсического действия ДИНФ полисистемного характера, степень выраженности которых зависела от вводимых доз. Так, в диапазоне доз от 1000,0 до 1,0 мг/кг у опытных крыс по сравнению с контролем установлены статистически значимые изменения показателей периферической крови: лейкопения, снижение лимфоцитов – в 1,5‒2,0 раза, моноцитов – в 1,3‒1,4 раза, гранулоцитов – в 1,5‒1,6 раза, уменьшение средней концентрации гемоглобина в эритроцитах на 5,0‒5,8 %, среднего объема тромбоцита – на 7,9‒13,3 % и тромбоцитоз при дозе 1000,0 мг/кг.

О проявлении нефротоксического действия ДИНФ в дозах от 1000,0 до 0,1 мг/кг свидетельствует установленное у опытных крыс снижение выведения с мочой железа, наличие глюкозурии и морфологические изменения почек в виде дистрофии эпителия проксимальных канальцев с признаками межуточного нефрита. Обращает на себя внимание характерная усиленная экскреция магния из организма, содержание которого в моче животных всех опытных групп превышало уровень контроля в 2,0‒3,3 раза ( p < 0,05) при введении всех испытанных доз от 1000,0 до 0,01 мг/кг.

При анализе биохимических показателей сыворотки крови опытных белых крыс при воздействующих дозах ДИНФ от 1000,0 до 10,0 мг/кг выявлено статистически значимое снижение содержания железа в 2,1‒5,4 раза, фосфора – в 1,2‒1,4 раза и увеличение уровня кальция в 2,0 раза при p < 0,05 по сравнению с контрольными животными.

Показателями токсического действия ДИНФ на функцию печени в дозах 1000,0 и 100,0 мг/кг явилось снижение ОКМ органа на 19,1 и 15,8 % ( p < 0,05), уменьшение в сыворотке крови содержания липопротеинов высокой плотности на 7,1 и 8,3 % ( p < 0,05) соответственно и рост уровня мочевины в 1,2 раза ( p < 0,05), признаки интерстициального гепатита и дистрофические изменения гепатоцитов.

Со стороны гормонального статуса белых крыс при воздействии ДИНФ в дозах от 1000,0 до 1,0 мг/кг наиболее выраженные изменения установлены со сто- роны содержания тироксина и тиреотропного гормона, уровни которых в сыворотке крови возрастали в 2,1‒3,3 и в 1,8‒2,5 раза соответственно по сравнению с контрольной группой (p < 0,05). Увеличение содержания свободного тироксина оказалось статистически значимым только при введении доз от 10,0 мг/кг и более, а свободного трийодтиронина – 1000,0 мг/кг. Патоморфологические нарушения щитовидной железы у опытных лабораторных животных при воздействующих дозах ДИНФ от 1000,0 до 1,0 мг/кг характеризовались увеличением размеров фолликулов и изменением их эпителия, которые отсутствовали при снижении уровней воздействия препарата.

Проявлением антиандрогенной активности ДИНФ в диапазоне доз от 1000,0 до 1,0 мг/кг явилось достоверное снижение в сыворотке крови опытных животных концентрации тестостерона в 2,6‒3,9 раза и тенденция к увеличению уровней прогестерона, эстрадиола, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов при р ≥ 0,05 в сравнении с данными контрольных животных.

Изменений в содержании в сыворотке крови опытных животных кортизола и дегидроэпиандростерона, гормонов коры надпочечников не обнаружено. При морфометрических исследованиях выявлено увеличение у опытных крыс коркового слоя надпочечников в 3,0‒3,8 раза ( p < 0,05) и ОКМ органа при дозе 1000,0 мг/кг в 1,6 раза при p < 0,05. Изменений гормонального статуса белых крыс при введении ДИНФ многократно в дозе 0,1 мг/кг не выявлено, что позволяет принять ее в качестве недействующей по специфическому признаку.

Нарушений со стороны неспецифического гуморального иммунитета по содержанию компонентов комплемента (С 3 , С 4 ) и иммуноглобулинов А, G, М в сыворотке крови белых крыс при введении ДИНФ во всех сериях опытов не установлено.

При проведении цитогенетического анализа лейкоцитов крови опытных крыс по окончании хронического эксперимента установлена способность ДИНФ в дозах от 1000,0 до 1,0 мг/кг вызывать различные повреждающие эффекты генетических структур в виде усиления процессов клеточной пролиферации с одновременным ростом количества микроядер и клеток с признаками некроза при снижении содержания молодых форм.

Следовательно, результаты комплексных клинико-биохимических, морфологических, морфометрических и цитогенетических исследований свидетельствуют, что в условиях хронического внутриже- лудочного воздействия дозы ДИНФ от 1000,0 до 0,1 мг/кг являются действующими по общетоксическому влиянию на организм. В качестве величины порога хронического действия может быть принята доза 0,01 мг/кг, лимитирующим показателем которой является нефротоксический эффект по экскреции магния с мочой (биологический маркер). Проявление токсического действия на эндокринную систему выявлено при поступлении ДИНФ в организм экспериментальных животных в дозах, превышающих порог хронического действия в сто раз.

Экспериментальное изучение отдаленных эффектов влияния ДИНФ на организм включало изучение репродуктивной токсичности (эмбриотропное, тератогенное и гонадотропное действие), а также наличие мутагенных и цитотоксических свойств.

Воздействие ДИНФ при внутрижелудочном введении в дозе 10 000,0 мг/кг во время беременности вызвало статистически значимое увеличение в 3,5 раза общей эмбриональной и постимплантационной смертности до 29 %, наличие множественных (сочетанных) пороков развития.

При снижении вводимых доз ДИНФ до 100,0 мг/кг наблюдалось уменьшение числа аномалий развития эмбрионов (микрофтальмия у 4,8 %), которые отсутствовали при дозе 10,0 мг/кг.

При наблюдении за процессом постнатального развития потомства, полученного от самок белых крыс, перенесших интоксикацию ДИНФ в период беременности в дозе 10 000,0 мг/кг, обнаружено увеличение смертности крысят на 22,7 % ( p < 0,05). Изучение гормонального статуса потомства (самцы) на 60-е сутки опыта при дозах ДИНФ на уровне 1000,0 и 100,0 мг/кг выявило нарушение функционального состояния щитовидной железы и гонад, что проявилось ростом в сыворотке крови уровней общего тироксина в 2,0 и 2,3 раза ( p < 0,05) и тиреотропного гормона в 2,1 и 2,3 раза ( p < 0,05), а также снижением концентрации тестостерона в 2,3 и 2,9 раза ( p < 0,05) по отношению к контролю соответственно. При этом морфофункциональные показатели гонад самцов крыс (ОКМ семенников и придатков, концентрация общая, подвижных и неподвижных сперматозоидов, средняя скорость подвижных сперматозоидов) оставались без существенных изменений [20, 21].

Изучение воздействия на гонады в опытах на половозрелых самцах белых крыс после двухмесячного введения в желудок ДИНФ в дозах от 10 000,0 до 100,0 мг/кг и шестимесячного в дозах от 1000,0 до 0,01 мг/кг нарушений функциональных показателей сперматозоидов не установлено. Однако при морфологическом исследовании семенников через 60 дней воздействия выявлено снижение у опытных крыс сперматогенеза и уменьшение размеров семенных канальцев со снижением послойности и клеточности, при этом сперматогенез завершался стадией сперматоцитов и сперматид. Аналогичные изменения установлены при увеличении периода воздействия ДИНФ в дозах от 1000,0 до 1,0 мг/кг до шести месяцев. При максимально испытанной дозе препарата количество зрелых сперматозоидов в семенных канальцах опытных крыс снижалось в 5,4 раза (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой.

Следовательно, экспериментальным путем установлена причинно-следственная связь нарушений репродуктивной функции организма белых крыс при воздействии ДИНФ в зависимости от вводимых доз, причем недействующей дозой препарата является 0,1 мг/кг.

Результаты оценки мутагенной активности ДИНФ в тесте Эймса на штаммах Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 97 и TA 102 в концентрациях 0,3; 0,6; 1,3; 2,5 и 5,0 мг/мл в вариантах без метаболической активации и с наличием таковой указывают на отсутствие мутагенного действия. При анализе цитогенетических препаратов костного мозга и селезенки спустя 24 ч после однократного внутрибрюшинного введения белым мышам в дозе 2000,0 мг/кг увеличения аберраций хромосом не выявлено. Различий между опытной и контрольной группами животных по числу клеток с признаками апоптоза (интерфазный тип гибели) и числу полиплоидов в костном мозге не установлено. Однако в селезенке опытных белых мышей обнаружено статистически значимое снижение в 5,0 раза количества клеток с признаками апоптоза и увеличение в 4,0 раза числа полиплоидов по сравнению с контрольными данными ( p < 0,05).

Таким образом, при однократном внутрибрюшинном введении белым мышам ДИНФ не проявлял мутагенных свойств по числу хромосомных аберраций, но приводил к изменению процессов деления, дифференцировки и гибели клеток селезенки. Это может быть обусловлено тем, что цитотоксическому действию ДИНФ в наибольшей степени подвержены активно пролиферирующие клетки организма теплокровных животных, в том числе эмбриональные, что может являться одним из возможных механизмов его эмбриотоксического (тератогенного) действия. Выявленное влияние на репродуктивную и эндокринную системы носит вторичный характер в результате повреждающего действия ДИНФ на организм вследствие формирования структурных и функциональных изменений в клетке.

Показателем безопасности материалов и изделий медицинского назначения на полимерной основе является допустимое количество миграции ДИНФ в модельные среды (дистиллированная вода). Расчет регламента выполнен в соответствии с методическими подходами по обоснованию гигиенических нормативов химических веществ в водной среде с определением лимитирующего критерия вредности по органолептическим, общесанитарным и токсикологическим показателям.

Изучали влияние ДИНФ на регламентированные органолептические и общесанитарные показатели воды при его максимально достижимой концентрации в воде, которая составляет 0,6 мг/дм3. При указанной концентрации влияние ДИНФ на запах, привкус, мутность, цветность, пенообразова- ние, перманганатную окисляемость, бромируемость и другие показатели воды не обнаружено, то есть испытанная концентрация является недействующей.

В то же время в хроническом эксперименте на белых крысах, в котором исследовали токсическое действие ДИНФ при внутрижелудочном введении, по лимитирующему показателю нефротоксического действия установлена пороговая доза, равная 0,01 мг/кг.

Максимальная недействующая концентрация, рассчитанная по токсическому критерию вредности с учетом коэффициента запаса – 10, средней массы человека и объема суточного водопотребления, составила 0,02 мг/дм³. Однако определение данной концентрации ДИНФ в модельных средах не представляется возможным (так как чувствительность современного метода его контроля составляет 0,05 мг/дм³)⁶. В связи с этим обоснован и утвержден регламент допустимого количества миграции ДИНФ со значением «Не допускается» ( < 0,05 мг/дм³), что обеспечивает санитарно-гигиенический контроль и безопасное обращение материалов и изделий медицинского назначения, изготовленных на полимерной основе с его содержанием.

Выводы. В результате проведения комплексных токсиколого-гигиенических исследований дана полная токсикологическая оценка ДИНФ в острых, субхронических и хронических опытах при внутрижелудочном поступлении в организм экспериментальных животных. Установлен политропный характер общетоксического дозозависимого действия ДИНФ на органнотканевом уровне и специфическое повреждающее действие на эндокринную и репродуктивную системы экспериментальных животных. В хронических экспериментах выявлены количественные закономерности и характер проявлений токсического действия ДИНФ, определены нефротоксический лимитирующий показатель и биологический маркер порога его ведущего вредного действия на организм. По критерию токсичности обоснован и утвержден регламент допустимого количества миграции ДИНФ из полимерных материалов, обеспечивающий гигиеническую оценку и безопасное обращение материалов и изделий медицинского назначения, изготовленных на полимерной основе с его содержанием.

Полученные особенности и закономерности токсического действия ДИНФ могут использоваться для определения референтных уровней безопасности по критериям допустимого риска для здоровья.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.