Особенности внутриклеточной сигнализации в лейкоцитах периферической крови при лазерном облучении в условиях in vitro

В настоящем исследовании представлены данные о характере ответа периферических лейкоцитарных клеток при действии низкоинтенсивного лазерного излучения. Подобный подход к выяснению характера взаимодействия «лазерный луч – изолированная клетка» в условиях in vitro позволяет выявить общность и различия в сигнализирующих путях в ответ на действие НИЛИ в различных типах гемопоэтических клеток.

Материалы и методы. В работе использовались эозинофилы периферической крови (ЭПК) и сегментоядерные нейтрофилы (СЯН). Донорами образцов крови были здоровые люди и больные с выраженной эозинофилией. Выделение ЭПК и СЯН осуществлялось методом центрифугирования на непрерывном градиенте плотности фиколла-урографина (1,115; 1,096; 1,078 г/мл). После этого из отдельных слоев с помощью микропипетки забиралось 10 мкл взвеси клеток и переносилось на предметное стекло, расположенное над водяной баней при температуре + 37° С. Выделенная взвесь клеток облучалась способом медленного сканирования. По окончании процедуры облучения готовились мазки стандартным лабораторным спосо- бом, которые в последующем фиксировались и окрашивались азур-эозином по романовскому-гимзе. Контролем служили мазки взвеси клеток крови, не подвергшихся лазерному облучению.

В качестве источника лазерного излучения использовался лазерный излучатель аппарата «Улей 2 км», который располагался перпендикулярно на расстоянии 5 мм, площадь «светового пятна» составляла 21 мм2. В этом эксперименте использовали лазерный терапевтический аппарат «Улей 2 км», длиной волны 0,89 мкм, работающий в инфракрасном диапазоне и в импульсном режиме. Использовалась мощность 25 мВт, экспозиция 8 мин.

Зимография проводилась на гелевой пленке (1 % раствор агарозы (icn) на кальциевом буфере (20 mm CaCl 2 ; 150 mm NaCl; 50 mm tris-Cl, Ph 7,4) с добавлением 0,2 % желатина). Пленку помещали в чашку Петри, куда при помощи автоматической пипетки наносили взвесь клеток по 10 мкл. Чашку Петри закрывали и помещали в термостат при температуре 37 ° С на 16 ч. Фиксация полученных зимограмм осуществлялась в 20 %-ной уксусной кислоте в течение 30 мин, окрашивание геля производилось coomassie brilliant blue r-250 (40 % метилового спирта, 7 % уксусной кислоты, 15 % изопропанола, 0,1 % coomassie brilliant blue). Затем проводилась отмывка окрашенного геля в 7 %-ной уксусной кислоте. После отмывки гель сканировался в стандартных условиях в проходящем свете, и на сканированных изображениях определяли яркость области лизиса с помощью программы анализа изображений «imagescope m».

С целью изучения механизма дегрануляции под воздействием НИЛИ применялся раствор ве- рапамила (1,5·10–5 м). Для этого к выделенной взвеси добавляли 2 мкл раствора верапамила, после чего через 2 мин воздействовали НИЛИ.

Результаты исследования. В исследовании использовались эозинофилы и сегментоядерные нейтрофилы, выделенные из крови в непрерывном градиенте плотности фиколла-урографина. Полученные популяции эозинофилов и СЯН подвергались лазерному облучению методом медленного сканирования.

Воздействие НИЛИ на сегментированные нейтрофилы не вызвало морфологической перестройки этих клеток (табл. 1). Но при этом СЯН сохраняли способность к дегрануляции. Последнее было подтверждено методом прямой зимографии. Так, облученные СЯН повышали протеолитическую желатиназную активность, что наблюдалось в виде увеличенной зоны просветления вокруг помещенных на предметное стекло нейтрофильных лейкоцитов. Яркость пятна лизиса СЯН без облучения составила 205 (195; 210) усл. ед., после облучения 216 (216; 216) усл. ед. Различия между группами явились достверными, коэффициент Манна–Уитни составил р = 0,0306. При этом все количественные характеристики СЯН оставались без изменения в сравнении с исходной морфологической картиной этой популяции лейкоцитов.

В ЭПК после воздействия НИЛИ отмечено увеличение площади, периметра, диаметра, оптического пропускания, снижение средней и интегральной оптических плотностей (табл. 2), связан- ное с наблюдающейся выраженной дегрануляцией этих форменных элементов. При проведении зимографии яркость пятна лизиса ЭПК без облучения составила 235 (216; 245) усл. ед., после облучения 247,5 (229; 253) усл. ед. Различия между группами явились достоверными, коэффициент Манна–Уитни составил р = 0,0292. Кроме того, в облученных ЭПК констатировалась трансформация ядра клетки. А именно, ядро из билобарного становилось овальным, лишалось сегментации, обычно наблюдаемое у эозинофилов. Это значительно меняло ядерно-цитоплазматическое соотношение и повышало прозрачность клетки в целом. Выявленный эффект отменялся при облучении ЭПК после предварительной обработки эозинофилов блокатором кальциевых каналов – верапамилом (табл. 2).

Обсуждение результатов. Эозинофилы и сегментоядерные нейтрофилы периферической крови в условиях in vitro однотипно отвечают на НИЛИ в виде дегрануляции. Вместе с тем, дегрануляция ЭПК одновременно сопровождается изменением формы ядра. Двулобарное ядро трансформируется в овалоподобное. СЯН при действии НИЛИ сохраняют способность к экзоцитозу гранул, но транформации ядра в этих клетках не наблюдается. Эти различия в ответах эозинофилов и нейтрофилов на НИЛИ позволяют предположить наличие различных путей сигнализации при лазерном воздействии на процесс экзоцитоза и ремодуляцию ядерного хроматина.

Таблица 1

Сравнение влияния НИЛИ (λ = 0,89 мкм, общая энергия 12 Дж) на нейтрофилы

Таблица 2

Сравнение влияния НИЛИ (λ = 0,89 мкм, общая энергия 12 Дж) на ЭПК без фармакологического влияния, и ЭПК, обработанные раствором верапамила

Примечание. * – различие с интактными клетками достоверно, р < 0,05; В – обозначение предварительной обработки ЭПК раствором верапамила.

Проблемы здравоохранения

Прежде всего, об общем ответе исследуемых лейкоцитов на лазерное излучение, процессе дегрануляции. В данном случае констатируется, что процесс дегрануляции является кальцийзависи-мым. Дегрануляция наблюдается только при лазерной активации кальциевых каналов. Так предварительная обработка исследуемых лейкоцитов верапамилом отменяет дегрануляцию в ответ на НИЛИ [6]. Становится понятным, что при действии НИЛИ на клетку повышение концентрации кальция в цитоплазме является решающим звеном в организации процесса экзоцитоза гранул [3]. В исследованиях последних лет принят постулат, что регулируемая дегрануляция в ответ на действие гормонов, биологически активных веществ является кальцийзависимым процессом [1]. Конкретно кайма вокруг гранул в виде коатомеров (Со I и Co II) и других дополнительных низкомолекулярных белков, прохождение через цис- и транс-отделы комплекса Гольджи и слияние с цитоплазматической мембраной – все это процессы, требующие участия кальция. Наше заключение об индуцированном действии НИЛИ на процесс дегрануляции подтверждает ранее высказанное Т.Й. Кару [2] положение о каскадности реакции в живой клетке при лазерном воздействии.

Подобный механизм включения сигнальных путей также объясняется при развитии хроматин-деконденсирующего феномена в эозинофилах при действии НИЛИ. Повышение концентрации кальция в цитоплазме после лазерного облучения ЭПК вызывает активацию инозитольного каскада. В частности, поступающий извне кальций активирует фосфолипазу С, которая образует из 4,5-инозитолбифосфата два активных мессенджера – 1,4,5'-инозитолтрифосфат и диацилглицерол [4]. Инозитолтрифосфат является активным вторичным месседжером, участвующим в динамике изменений концентрации Са2+ в цитоплазме и нуклеоплазме [8]. Это подтверждается наличием рецепторов в эндоплазматическом ретикулуме, внешней и внутренней мембранах ядра [5]. Авторы при выделении внешней и внутренней мембран ядра различными морфологическими методами показали, что внутренняя мембрана ядра содержит инозитолтрифосфат. При культивировании изолированных ядер гепатоцитов добавление инозитолтрифосфата в течение нескольких секунд усиливало транспорт изотопа 45Са2+. Следует подчеркнуть, что инозитолтрифосфат не только триггирует выход Са2+ из эндоплазматического ретикулума, но и движение Са2+ между цитоплазмой и нуклеоплазмой.

При повышении концентрации Са2+ в нуклеоплазме активируется ядерная протеинкиназа [9], которая в свою очередь фосфорилирует ядерные ламины, выстилающие внутреннюю мембрану ядра. Ядерные ламины представлены филаментами промежуточного типа и играют большую роль в образовании формы ядра и структуры ядерного хроматина [7]. Это свойство объясняется тем, что ламины при посредничестве с низкомолекулярными белками присоединены к гетерохроматину. Так, ламина-В-рецептор с одной стороны соединен с ламиной В, а с другой – с гетреохромным белком. Последний имеет непосредственную связь с гетерохроматином. В этой связи становится понятным разрыв связующего комплекса с хроматином при фосфорилировании ламин протеинкина-зой С, так как фосфорилирование ламин меняет их свойства. Ламины, например, полностью растворяются в период митотического цикла. В условиях нашего эксперимента фосфорилирование ламин сопровождается ослаблением их свойств – поддерживать связь с гетерохроматином посредством взаимодействия с вспомогательными низкомолекулярными белками. Эти изменения в функции ламин проявляются в феномене деконденсации хроматина при действии НИЛИ на клетку.

Заключение. Таким образом, низкоинтенсивное лазерное облучение эозинофилов следует рассматривать как каскад взаимосвязанных реакций различных компартментов, начиная с цитоплазматической мембраны, а именно, встроенных в мембрану кальциевых каналов. Активация последних сопровождается повышением концентрации Са²⁺ в цитоплазме. Являясь мультифункциональным вторичным мессенджером, кальций активирует многие сигнализирующие системы клетки посредством активации фосфолипазы С. Это, прежде всего, инозитолтрифосфат и диацилглицерол. Повышение инозитолтрифосфата в цитоплазме сопровождается его взаимодействием с рецепторами инозитолтрифосфата в сакркоплазматическом ретикулуме и мембране ядра. Результатом этого взаимодействия является повышение свободного кальция в нуклеоплазме. Свободный кальций активирует ядерную протеинкиназу С, которая фосфорилирует ламины внутренней мембраны и изменяет их способность связываться с гетерохроматином посредством разобщения ламин с низкомолекулярными белками типа ламин-В-рецептор и гетерохроматиновым белком. Эта ситуация приводит к деконденсации хроматина. Ядерный хроматин становится гомогенным, без выделения территорий эу- и гетерохроматина. Однако гомогенный хроматин остается четко окружен ядерной оболочкой.