Особенности взаимодействия этилового спирта с этанолокисляющей системой организма человека

В связи с расширением ассортимента и ростом потребления тонизирующих и гармонизирующих напитков возникает потребность в оценке возможных вариантов взаимодействия этилового спирта с компонентами основного сырья. Особое значение приобретает потребность получения новых сведений о метаболизме этилового спирта и сопутствующих веществ в организме человека под воздействием ферментных систем. Такой метаболизм (биотрансформация) может происходить в печени, почках, стенке кишечника организма человека. Вещества, проходящие процессы метаболизма, могут становиться более или менее активными [1].

Этиловый спирт используется как пищевой продукт и как сырье для приготовления водок, ликероводочных изделий, крепленых вин, а также в ряде отраслей промышленности. В силу длительной истории употребления алкоголя накоплен большой материал по различным аспектам его использования [2].

Значительно осложняет проведение исследований по оценке взаимодействия этанолметаболизирующей системы и этилового спирта присутствие в последнем микропримесей (сивушных масел, являющихся смесью высших спиртов - амилового, изоамилового, изобутилового, пропилового, изопропилового и др.) [3].

В статье представлены результаты исследований, которые отражают особенности взаимодействия этилового спирта с ферментами, входящими в состав этанолокисляющей системы организма человека.

Анализ состава спиртов различных марок. Степень очистки спирта-ректификата определяет его товарный сорт. В основу деления ректифицированного спирта на сорта положен техноло- гический принцип, а основным признаком является содержание примесей в разных сортах. В сортах «Люкс» и «Экстра» учитывается также качество сырья. Для их производства пригодно только кондиционное зерно. Для спирта высшей очистки и первого сорта используется любое пищевое сырье. Различия в сырье и степени очистки спирта обусловливают формирование его определенных органолептических и физико-химических показателей. В связи с тем, что Россия вступила в ВТО, проводится работа по гармонизации отечественных стандартов, т.е. приведение их в соответствие с международными нормами [4].

Проведена оценка качественного состава содержащихся примесей в этиловых спиртах, расшифровка результатов хроматографического анализа представлена в таблице 1.

Таблица 1

Содержание различных примесей в этиловых спиртах

Наименование соединений	Массовая доля сопутствующих веществ в этиловом спирте у различных производителей, мг/100 г
	Индекс	Альфа	Люкс	Экстра	Высшей очистки
Объемная доля этилового спирта, %, не менее	норматив	96,2	96,0	96,3	96,3
	факт	96,2	96,0	96,3	96,3
Проба на чистоту серной кислотой	норматив	выдерживает
	факт	выдерживает
Проба на окисляемость, мин, при 20оС, не менее	норматив	20	22	20	15
	факт	20-23	22-25	20-21	15-17
Массовая концентрация альдегидов в пересчете на безводный спирт, мг/дм3, не более	норматив	2	2	2	4
	факт	0,08-1,15	1,05-1,95	1,53-1,99	2,86-3,57
Изоамиловый и изобутиловый спирты (3:1) в пересчете на безводный спирт, мг/дм3, не более	норматив	2	2	3	4
Массовая концентрация сивушного масла: 1-пропанол, 2-пропанол, спирт изобутиловый, 1-бутанол, спирт изоамиловый в пересчете на безводный спирт, мг/дм3, не более	норматив	6	6	6	8
	факт	1,01-4,51	3,67-5,12	3,86-5,95	5,00-7,50
Массовая концентрация сложных эфиров в пересчете на безводный спирт, мг/дм3, не более	факт	0,05-1,75	1,20-1,75	1,64-2,83	3,45-3,77
Объемная доля метилового спирта в пересчете на безводный спирт, %, не более	норматив	0,003	0,03	0,03	0,05
	факт	0,0005-0,0011	0,011-0,023	0,018-0,029	0,034-0,045
Массовая концентрация свободных кислот (без СО2) в пересчете на без водный спирт, %, не более	норматив	12	8	12	15
	факт	4,5-10,3	4,0-5,8	6,8-11,5	10,2-12,9
Массовая концентрация сухого остатка в пересчете на безводный спирт, мг/дм3, не более	норматив	-	-	-	-
	факт	-	-	-	-
Массовая концентрация азотистых летучих оснований, в пересчете на азот, в 1 дм3 безводного спирта, мг, не более	норматив	-	-	-	-
	факт	-	-	-	-

Исследуемые образцы этилового спирта содержат различное количество микропримесей, причем отмечены весьма значительные колебания в их качественном и количественном составе даже в пределах одного сорта.

Спирты «Альфа» выделялись среди остальных более низкой объемной долей метилового спирта в пересчете на безводный спирт, в то время как спирты высшей очистки различных производителей по большинству нормируемых показателей характеризовались как менее однородные по качественному и количественному составу сопутствующих веществ . Проба на окисляемость при 20оС была минимальной и колебалась в интервале 15-17 мин. Спирты «Люкс» и «Экстра»

близки между собой и, как правило, лишь по одному-двум из десяти показателей не могли попасть в более высокую сортовую группу. С учетом нормируемых физико-химических показателей отметим, что производители спиртов добросовестно маркируют свою продукцию с учетом требований действующего ГОСТа.

Исследование особенностей взаимодействия этилового спирта и ацетальдегида с эта-нол-метаболизирующей системой организма человека . К этанол-метаболизирующей системе организма человека относятся алкогольдегидрогеназа (АДГ) и митохондриальная ацетальдегидрогеназа (АЛДГ), которые катализируют один из важнейших процессов - ферментативный гидролиз этилового спирта, а также сопутствующие вещества, попадающие в организм человека. Это лежит в основе ряда биологических явлений, проявляющихся в широком диапазоне степени гидролиза этанола от ограниченного при нерациональных параметрах действия ферментов до глубокого гидролиза при пищеварении.

Дальнейшее исследование направленно на изучение процесса деградации этиловых спиртов различных сортов под влиянием АДГ. В таблице 2 показано разрушение этилового спирта различных сортов под влиянием АДГ после продолжительности воздействия 1 мин.

Таблица 2

Разрушение этиловых спиртов различных сортов под влиянием АДГ

Фермент-субстратное соотношение	Количество алкогольдегидрогеназы (мкл) для окисления субстрата (г), при активности АДГ, Е/г белка фермента
	1∙103	2∙103	3∙103	4∙103
	2,17±0,13	1,08±0,06	0,72±0,04	0,54±0,03
	2,51±0,16	1,26±0,08	0,85±0,05	0,65±0,04
1:1	2,70±0,17	1,33±0,10	0,97±0,06	0,72±0,04
	2,79±0,18	1,40±0,08	1,12±0,07	0,80±0,05
	21,73±1,30	10,85±0,54	7,23±0,36	5,42±0,33
	22,82±1,36	11,95±0,60	7,64±0,38	5,74±0,28
1:10	23,47±1,41	12,79±0,64	7,89±0,40	5,96±0,30
	24,55±1,47	13,76±0,69	8,75±0,44	6,02±0,31
	217,39±10,87	108,53±6,51	72,33±4,33	54,25±3,26
	228,23±11,41	113,99±6,84	75,94±4,56	58,59±3,50
1:100	230,43±11,52	116,35±6,98	76,32±4,57	59,03±3,54
	234,36±11,72	117,18±7,03	78,20±4,69	61,32±3,68
	237,62±11,88	119,38±7,16	79,56±4,77	62,19±3,73
	2173,94±130,43	1085,97±65,11	723,33±43,38	542,56±32,55
	2217,17±133,11	1106,72±67,02	759,49±45,56	569,10±34,14
1:1000	2238,19±134,98	1129,41±68,01	765,24±45,91	607,04±35,31
	2303,45±137,52	1257,56±75,42	795,26±47,70	612,38±36,17

Примечание. Первая цифра в столбце - теоретическая, вторая, третья и четвертая - соответственно для спирта «Альфа», «Люкс», «Экстра» и высшей очистки.

Анализ результатов проведенных исследований позволил установить некоторые особенности биотрансформации этанола под влиянием алкогольдегидрогеназы. Показано, что необходимое количество ферментного препарата не совпадает с тем, которое получено расчетным путем; колебания в значениях могут достигать значительных величин в зависимости от фермент-субстратного соотношения и окисляемого этанола – от сорта спирта.

С повышением активности ферментного препарата, а также с увеличением его рабочей концентрации в растворе количество алкогольдегидрогеназы для окисления субстрата снижается. Наименьшее теоретическое количество АДГ отмечено на уровне 0,54±0,03 мкл, в реальных же условиях это количество в 1,48 раза превышает теоретическое значение (сравнение проводили со спиртом высшей очистки, фермент-субстратное соотношение 1:1). Увеличение концентрации субстрата в реакционной системе в 10, 100 и 1000 раз при прочих равных условиях привело к увеличению требуемого количества АДГ по сравнению с расчетным соответственно в 1,11; 1,14 и 1,13 раза. Кроме того, можно предположить, что сопутствующие этиловому спирту компоненты оказы- вают в некоторой степени ингибирующее действие на активные центры АДГ. Так, при фермент-субстратном соотношении 1:1 и активности АДГ на уровне 1∙103 Е/г расчетное количество ферментного препарата составило 2,22±0,11 мкл, для спиртов «Альфа», «Люкс», «Экстра» и высшей очистки эти значения возросли в 1,05; 1,08; 1,09 и 1,11 раза соответственно. Аналогичная тенденция также установлена нами как при увеличении дозы ферментного препарата, так и при кратном увеличении концентрации субстрата. Для исследуемых систем наибольший разброс расчетных и практических значений характерен для фермент-субстратного соотношения 1:10, минимальные -для соотношения 1:1000. Данный факт, вероятно, связан с конкуренцией на межфазной границе ферментного препарата за молекулы этилового спирта.

В таблице 3 после соответствующей обработки приведена расшифровка результатов хроматографического анализа (фермент-субстратное соотношение 1:1, активность АДГ 4∙103 Е/г).

Таблица 3

Результаты хроматографического анализа спиртов «Альфа» до и после ферментолиза АДГ

Вещество	Массовая доля, об. %
	до ферментолиза	после ферментолиза
Этиловый спирт	96,2±0,01187	4,75±0,29
Ацетальдегид	1,16±0,0601	0,92±0,0,5
Изоамиловый спирт	0,03±0,0002	0,02±0,0001
Изобутиловый спирт	0,01±0,0006	-

Хроматографический профиль спирта «Альфа» до и после ферментолиза показал, что исследуемый препарат АДГ специфичен к этиловому спирту (объемная доля снизилась в 20,3 раза) и изобутиловому спирту (на хроматограмме отсутствует пик этого вещества). В препарате имеются примеси АЛДГ (снижение концентрации отмечено на уровне 20,7%) и изоамилдегидрогеназы (снижение концентрации отмечено на уровне 33,3%).

В целом полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования АДГ в качестве гармонизирующего ингредиента в технологии напитков со специальными свойствами.

Дальнейшие исследования направлены на изучение процесса деградации ацетальдегида под влиянием альдегидегидрогеназы. Первым продуктом распада этилового спирта является ацетальдегид. Нами проведены необходимые эксперименты, которые позволяют судить о распаде ацетальдегида в условиях in vitro , максимально приближенных к организму человека. При планировании эксперимента учитывали собственную массовую долю уксусного альдегида в спирте, содержащуюся до ферментации спирта АДГ (несмотря на ее низкую концентрацию), и реальное количество данного субстрата, образовавшегося после биокаталитического расщепления этанола алкогольдегидрогеназой. В таблице 4 показано теоретическое и реальное разрушение альдегидов в различных сортах под влиянием АЛДГ.

Установлено, что биотрансформация ацетальдегида подчиняется тем же общим законам, что и каталитическое окисление этилового спирта; принципиальных отличий, связанных с аномальным протеканием процессов и артефактов во взаимодействии субстрата и АЛДГ, не выявлено.

Показано, что наименьшие различия в теоретических и практических результатах установлены в том случае, когда субстратом служил спирт сорта «Альфа», что, возможно, связано с наличием сопутствующих веществ (высших спиртов и пр.). С увеличением активности ферментного препарата требуемое количество альдегиддегидрогеназы для окисления субстрата пропорционально снижается.

В таблице 5 приведена расшифровка результатов хроматографического анализа (фермент-субстратное соотношение 1:1, активность АЛДГ 4∙103 Е/г). При выполнении исследований в пробу перед обработкой АЛДГ дополнительно вносили 0,01±0,0006 изобутилового спирта.

Таблица 4

Фермент-субстратное соотношение	Количество альдегиддегидрогеназы (мкл) для окисления субстрата (г), при активности АЛДГ, Е/г белка фермента
	1∙103	2∙103	3∙103	4∙103
	2,22±0,11	1,11±0,07	0,73±0,04	0,55±0,30
	2,33±0,12	1,17±0,08	0,77±0,05	0,57±0,32
1:1	2,40±0,14	1,19±0,09	0,79±0,06	0,59±0,33
	2,44±0,15	1,22±1,11	0,82±0,06	0,62±0,34
	2,47±0,17	1,25±1,12	0,85±0,06	0,66±0,38
	22,22±1,33	11,11±0,67	7,34±0,44	5,50±0,33
	23,55±1,41	11,67±0,70	7,78±0,47	5,78±0,34
1:10	23,99±1,44	11,78±0,72	8,05±0,49	5,93±0,36
	24,88±1,49	12,00±0,75	8,28±0,51	6,09±0,38
	26,88±1,61	12,20±0,76	8,59±0,52	6,30±0,40
	222,22±13,33	110,11±6,61	73,40±4,41	55,50±3,34
	233,33±13,67	115,62±6,72	75,78±4,52	58,27±3,48
1:100	235,56±13,98	117,82±6,95	77,80±4,65	58,84±3,53
	239,99±14,37	118,92±7,16	79,27±4,76	59,94±3,60
	244,42±14,67	120,02±7,21	80,00±4,81	61,03±3,67
	2220,22±133,21	1100,11±66,05	734,03±44,07	550,00±32,96
	2309,03±136,37	1133,11±67,99	770,73±46,20	577,51±34,66
1:1000	2331,23±139,87	1145,77±68,75	785,41±47,12	583,65±35,02
	2353,34±142,05	1154,27±69,27	792,75±47,56	593,03±35,59
	2401,07±144,06	1165,75±69,96	800,09±48,03	600,58±36,05

Примечание. Первая цифра в столбце - теоретическая, вторая, третья и четвертая - соответственно для спирта «Альфа», «Люкс», «Экстра» и высшей очистки.

Таблица 5

Вещество	Массовая доля, об. %
	до ферментолиза	после ферментолиза
Этиловый спирт	4,75±0,29	-
Ацетальдегид	0,92±0,0,5	0,0102±0,0005
Изоамиловый спирт	0,02±0,001	0,0143±0,001
Изобутиловый спирт	0,01±0,0006	0,008±0,0005

Теоретическое и реальное разрушение ацетальдегида под влиянием АЛДГ

Результаты хроматографического анализа спиртов «Альфа» до и после ферментолиза АЛДГ

Анализ показал, что АЛДГ характеризуется специфичностью как в отношении ацетальдегида, так и других веществ, находящихся в ферментируемой системе. Так, после окончания процесса не отмечается наличие этилового спирта, падение объемной концентрации ацетальдегида в 90,2 раза, изоамилового и изобутилового спиртов – в 1,4 и 1,25 раза. Эти результаты следует учитывать при проектировании рецептур гармонизирующих напитков.

В результате проведенных исследований можно сделать выводы: по хроматографическим профилям спиртов различных производителей установлено, что исследуемые образцы этилового спирта содержат различное количество микропримесей, причем отмечены весьма значительные колебания в их качественном и количественном составе даже в пределах одного сорта. Показано, что спирты «Альфа» выделяются среди остальных более низкой объемной долей метилового спирта в пересчете на безводный спирт, в то время как спирты высшей очистки различных производителей по большинству нормируемых показателей характеризуются как менее однородные по качественному и количественному составу сопутствующих веществ. Спирты «Люкс» и «Экстра» близки между собой и, как правило, лишь по одному-двум из десяти показателей не могут попасть в более высокую сортовую группу.

По результатам анализа разрушения этилового спирта различных сортов под влиянием АДГ установлено, что реально необходимое количество ферментного препарата не совпадает с тем, которое получено расчетным путем. Колебания в значениях могут достигать значительных величин в зависимости от фермент-субстратного соотношения и окисляемого этанола – от сорта спирта. Наименьшее теоретическое количество АДГ отмечено на уровне 0,54±0,03 мкл, в реальных же условиях это количество в 1,48 раза превышает теоретическое значение. Показано, что увеличение концентрации субстрата в реакционной системе в 10, 100 и 1000 раз при прочих равных условиях приводит к увеличению требуемого количества АДГ по сравнению с расчетным соответственно в 1,11; 1,14 и 1,13 раза.

По хроматографическому профили спирта «Альфа» до и после ферментолиза показано, что исследуемый препарат АДГ специфичен к этиловому (объемная доля снизилась в 20,3 раза) и изобутиловому спирту. В препарате имеются примеси АЛДГ и изоамилдегидрогеназы.

* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации.