«Оспавир» - новый препарат для первичной вакцинации против натуральной оспы двухэтапным методом

E-mail: obtk@virion.tomsknet.ru

«ОСПАВИР» – НОВЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПЕРВИЧНОЙ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ ДВУХЭТАПНЫМ МЕТОДОМ

Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г.Томск «НПО «Вирион», г. Томск

В ходе продолжительной кампании ликвидации оспы в мире, проводившейся с 1958 года по инициативе СССР Всемирной организацией здравоохранения, было достигнуто прерывание трансмиссии вируса натуральной оспы в человеческой популяции. Одним из результатов ликвидации оспы явилась отмена практически во всех странах мира обязатель- ных регулярных прививок против этой инфекции. В настоящее время лица в возрасте до 30 лет не имеют иммунитета против натуральной оспы. По мнению экспертов, среди других возрастных групп населения только 10-15% имеют остаточный иммунитет. В связи с этим с высокой вероятностью можно считать, что в крупных городах доля восприимчивого населения к вирусу оспы сегодня составляет от 80% до 90% [1]. Ряд обстоятельств заставляют проявлять определенную осторожность и повышенное внимание к проблеме поксвирусных инфекций. Одним из них является наличие естественных резервуаров вируса оспы обезьян в ряде стран Центральной и Западной Африки. Так, в 1996-1997 гг. этот возбудитель вызвал крупную эпидемию в Демократической Республике Конго: заболели 511 человек, а летальность составила около 4%. Для России и сопредельных государств эпидемическое значение имеет преимущественно вирус оспы коров, циркулирующий среди некоторых диких грызунов и способный вызвать у человека заболевание, лишь изредка протекающее в генерализованной форме.

Существование природного резервуара ортопоксвирусов, вовлекающего в инфекционный процесс человеческую популяцию, сохранение вируса на-63

туральной оспы в лабораториях некоторых стран и опасность использования возбудителя в качестве поражающего агента при биотерроризме обосновывают необходимость восстановления иммунитета к оспенным инфекциям и возобновления оспопрививания.

С полным основанием можно считать, что применение обычного метода иммунизации против оспы встретит ряд трудностей и окажется мало приемлемым из-за высокого риска развития поствакцинальных, прежде всего неврологических осложнений (НО). Частота НО у первично вакцинированных старших возрастных групп достигает 1 случай на 500-700 и даже 100 привитых [2]. Одним из способов решения этой проблемы является применение двухэтапного метода вакцинации (ДМВ), рекомендованного в 1979 г. Комитетом вакцин и сывороток МЗ СССР для первичной вакцинации против оспы детей старше 2 лет, имеющих риск поствакцинальных неврологических осложнений, а также подростков и взрослых. ДМВ предусматривает введение инактивированного вируса вакцины на первом этапе вакцинации для создания грундиммунитета с последующим введением живой оспенной вакцины. Клинические испытания и широкая апробация ДМВ были проведены в 1968-1978 гг. в детских ЛПУ Украинской ССР, г. Москвы и ряда других городов СССР. На первом этапе вакцинации вводили инактивированную оспенную вакцину производства Московского НИИ вирусных препаратов, которая представляла собой вирус вакцины (штамм Л-ИВП), инактивированный гамма-излучением с использованием изотопа Со60, с концентрацией общего белка (без учета стабилизатора) 1 мг/мл, разлитый по 0,5 мл в ампулы (10 доз) и лиофилизированный. На втором этапе вводили живую оспенную вакцину на основе штамма ЭМ-63 производства ТомНИИВС [3]. Однако метод не был внедрен в практику здравоохранения в связи с отменой обязательной вакцинопрофилакти-ки оспы. Кроме того, не были проведены испытания на взрослом контингенте, так как в соответствии с инструкцией по применению вакцинации в обязательном порядке подлежали дети в возрасте до 3 лет.

Целью настоящего исследования явилось разработка технологии оспенной инактивированной вакцины «ОспаВир» по одной дозе в ампуле для первичной вакцинации детей с 2-летнего возраста, подростков и взрослых при 2-этапном методе вакцинации против оспы.

В работе использован штамм Л-ИВП вируса вакцины, полученный в институте Листера (Англия, Элстри) путем накожных пассажей на кроликах и телятах сер. № 3404 (22.11.67 г.) и сер. 3414 (22.11.67 г.), соответствующий требованиям ВОЗ по оспенной вакцине. Вирус размножается на первич-но-трипсинизированных и перевиваемых клеточных 64

культурах, а также на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов. При накожном введении человеку и некоторым животным (кролики, морские свинки, телята и т.д.) вызывает образование специфических кожных элементов (везикул и пустул). Иммунизация человека и животных вирусом приводит к образованию специфических антител, агглютинирующих эритроциты петуха.

В наших исследованиях для получения препарата вирус вакцины репродуцировали в третьем пассаже на коже теленка. Инфекционную активность вируса определяли на хорионаллантоисных оболочках 12-дневных куриных эмбрионов и выражали в оспообразующих единицах на мл (ООЕ/мл). Инактивацию вируса проводили на радиационной установке гамма-излучением с использованием изотопа Со60. Содержание общего белка в исходном полуфабрикате вакцины после инактивации вируса и в целевом продукте до добавления стабилизаторов определяли по МУК 4.1/4.2.588-96 [4] с реактивом Несслера. Для разведения исходного полуфабриката до концентрации общего белка 100 мкг/мл использовали фосфатно-цитратный буферный раствор. Находили количество общего белка в объеме целевого продукта, рассчитывали объем исходного полуфабриката. Количество разбавителя, необходимого для разведения, находили как разницу между объемами целевого продукта и исходного полуфабриката. В нашем опыте исходный полуфабрикат разводили в 30-32 раза.

Антигенную активность вакцины определяли по способности вызывать у белых крыс образование нейтрализующих антител к вирусу вакцины. В опыте использовали белых крыс линии Wistar или нелинейных без различия пола массой 80-100 г. Крысам вводили по 0,5 мл препарата в хвостовую вену. Через 28 сут получали сыворотку крови от каждой крысы. Для контроля использовали сыворотку крови неиммунизированной крысы. Концентрацию вируснейтрализующих антител в сыворотке крови иммунизированных крыс определяли в реакции биологической нейтрализации на хорионаллантоисных оболочках 12-дневных куриных эмбрионов по методике, изложенной в ТУ 42.14.295-82, используя в качестве тест-штамма ОСО вируса вакцины (ФС 42-28-113-00П) ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Норма антигенной активности 10 доз инактивированной вакцины 1:640 была установлена Московским НИИВП. Для определения этого показателя для одной дозы вакцины «ОспаВир» использовали полуфабрикат, изготовленный по технологии вакцины МосНИИВП. Для этого были сформированы 4 группы крыс (табл. 1). Первой группе животных вводили 0,5 мл вакцины «ОспаВир» внутривенно однократно, при этом вводимый животному препарат имел концентрацию общего белка 100 мкг/мл, и доза содержала 50 мкг белка. Вторая группа крыс получала по 0,5 мл вакцины «ОспаВир» внутривенно

Таблица 1

Схема вакцинации животных

№ группы	Количество животных, гол.	Наименование исследуемого материала	Содержание одной прививочной дозы			Способ и кратность иммунизации	Сроки взятия крови
			Объем, мл	Общего белка, мкг	ООЕ
1	60	Вакцина «ОспаВир»	0,5	50	–	Внутривенно, однократно	28 сут после прививки
2	12	Вакцина «ОспаВир»	0,5	50	–	Внутривенно, двукратно с интервалом между прививками 7 дней	28 сут после второй прививки
3	12	Полуфабрикат вакцины «ОспаВир» (инактивированная вирусная жидкость)	0,5	500	—	Внутривенно, однократно	28 сут после прививки
4	12	Вакцина оспенная живая	0,5	–	106	Внутривенно, однократно	28 сут после прививки

двукратно с интервалом между инъекциями 7 дней, каждая вводимая животному доза препарата с концентрацией общего белка 100 мкг/мл содержала 50 мкг белка. Третью группу иммунизировали 0,5 мл полуфабриката вакцины с концентрацией общего белка 1000 мкг/мл однократно, вводимая доза содержала 500 мкг белка, что эквивалентно 10 дозам вакцины «ОспаВир» и равноценно содержимому 1 ампулы вакцины производства МосНИИВП. Четвертой контрольной группе крыс вводили внутривенно 0,5 мл раствора вакцины оспенной живой, содержащей 106 ООЕ, что соответствует одной прививочной дозе. Пробы крови животных брали через 28 дней после последней прививки. Определяли концентрацию вируснейтрализующих антител (титр) в сыворотке крови каждого животного, затем для каждой группы рассчитывали среднегеометрический титр и 95 % доверительный интервал для этого значения.

Специфическую безопасность оценивали по полноте инактивации вируса вакцины в опыте на 12-дневных куриных эмбрионах.

На первом этапе работы были проведены исследования по изучению общей дозы облучения вирусного материала, которая обеспечивала его полную инактивацию. Доза облучения зависит от исходной активности вирусного материала в полуфабрикате. Регламентированная в РП № 249-82 доза облучения составляет 1,75 x 10 6 Рентген для вирусного материала с исходной активностью 1-1,9 x 10 9 ООЕ/мл и 2,25 x 10 6 Рентген обеспечивает полную инактивацию вируса с активностью 2-5 x 10 9 ООЕ/мл.

Для установления оптимальной дозы облучения, обеспечивающей полную инактивацию вируса, мы использовали разные дозы облучения. Вируссодер-жащие жидкости с активностью 1,0x109 ООЕ/мл и 1,9x109 ООЕ/мл облучали дозой 1,75x106 Рент- ген. Инфекционный материал с активностью 4,4x109 ООЕ/мл и 5,2x109 ООЕ/мл инактивировали дозой 1,93x106 Рентген, исходя из технических возможностей оборудования. Результаты исследования показали, что доза облучения 1,75x106 Рентген полностью инактивирует вирус с активностью в диапазоне 1,0-1,9x109 ООЕ/мл, что подтверждает регламентированные нормы облучения. В материале с наибольшей исходной активностью 5,2x109 ООЕ/мл после обработки гамма-излучением дозой 1,93x106 Рен-ген живой вирус не был обнаружен. Эффективность инактивации вышеуказанными дозами была подтверждена отсутствием живого вируса во всех инактивированных сериях полуфабриката по истечении 2, 4 и 8 мес после облучения. Изученные нормы дозы облучения были заложены в нормативную документацию на производство вакцины «ОспаВир».

Результаты исследований антигенной активности вакцины показали (табл. 2), что введение препарата «ОспаВир» крысам вызывало образование вирус-нейтрализующих антител (ВНА) в крови животных во всех группах. Концентрация ВНА у крыс первой группы, привитых одной дозой вакцины, варьирова-

Таблица 2

Исследования антигенной активности вакцины «ОспаВир»

№ группы животных	Процент сероконверсий	СГТ (1/титр)	СГТ (lg 1/титр)
1	100	1:259,92	(2,415±0,139)lg
2	100	1:452,55	(2,656±0,075)lg
3	100	1:1522,19	(3,182±0,071)lg
4	100	1:958,92	(2,982±0,094)lg

Примечание: СГТ – среднегеометрический титр вирус-нейтрализующих антител.

ла от 1:40 до 1:1280 при этом среднегеометрический титр составил 1:259,92 (от 1:120,53 до 1:560,53) – lg/титр (2,415±0,139). Повторное введение одной дозы препарата «ОспаВир» (группа 2) сопровождалось увеличением количества антител: СГТ составил 1:452,55 (от 1:275,57 до 1:743,20) – lg/титр (2,656±0,075)lg. В третьей группе крыс, которым вводили 10 доз препарата, был выявлен СГТ ВНА 1:1522,19 (от 1:1036,54 до 1:2235,36) – lg/титр (3,182±0,071)lg, который соответствовал регламентированной норме антигенной активности (не менее 1:640) десятидозной инактивированной оспенной вакцины производства МосНИИВП. В контрольной группе, которой вводили одну дозу живой оспенной вакцины, выявленный СГТ ВНА составил 1:958,92 (от 1:527,66 до 1:1742,63) – lg/титр (2,982±0,094)lg. Таким образом, было показано, что вирус вакцины после инактивации сохранил свои антигенные свойства.

С целью защиты вирусного белка в процессе сублимации вакцины и сохранения свойств готового препарата в течение срока хранения была испытана стабилизирующая система – в конечной концентрации сахароза 5% и желатоза 1%. С этой целью были изготовлены 5 экспериментальных серий вакцины с добавлением стабилизатора после инактивации вируса. Стабильность свойств вакцины изучали по изменению антигенной активности препарата после высушивания и через 6, 27 мес хранения (табл. 3). В ходе изучения экспериментальных серий на всех этапах исследования было выявлено сохранение антигенной активности в пределах нормы. Следовательно, предложенный стабилизатор обеспечивает защиту активного компонента в течение заявленного срока годности 2 года.

Безопасность вакцины «ОспаВир» или полноту инактивации вируса оценивали по отсутствию оспин на хорионаллантоисных оболочках при её введении 12-дневным куриным эмбрионам. Испытания безопасности каждой серии вакцины проводили дважды: сразу после инактивации вируссодержащей жидкос-

Таблица 3

Изучение антигенной активности вакцины «ОспаВир» при использовании стабилизатора (сахароза 5%, желатоза 1%) на сроках хранения

№ серии вакцины СГТ ВНА 1/титр (норма не менее 1:80) После сублимации На сроке хранения 6 мес На сроке хранения 27 мес 2 1:380 1:200 1:640 4 1:179 1:280 1:403 5 1:126 1:142 1:285 7 1:160 1:201 1:403 8 1:253 1:253 1:320 ти и в готовом препарате. Ни в одном из субстратов живой вирус не был обнаружен.

Три серии вакцины были направлены на полный фармакопейный контроль в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Испытания препарата подтвердили соответствие показателей качества нормам, заявленным в проекте ФСП. Было получено разрешение на проведение клинических испытаний препарата. Клинические исследования были проведены в соответствии с программой, согласованной с ГИСК им. Л.А. Тарасевича и утвержденной Комитетом медицинских иммунологических препаратов (МИБП) и Минздравом России.

Изучение реактогенности вакцины «ОспаВир» проводилось в два этапа. На первом этапе оценивали характер и частоту поствакцинальных реакций при введении инактивированной вакцины. На втором этапе вакцинации вводили живую оспенную вакцину, проводили наблюдение и оценку степени проявления общих и специфических местных реакций с учетом развития вакцинального процесса.

После проведения первого этапа вакцинации регистрировались общие реакции у 5,7% волонтеров в виде слабо выраженной температурной реакции, недомогания, головной боли. Местные реакции наблюдались у 9,6% добровольцев в виде слабой болезненности в месте введения вакцины. Все общие и местные реакции у вакцинируемых по степени выраженности были оценены как слабые.

Вакцинация живой оспенной вакциной сопровождалась допустимыми поствакцинальными реакциями, все симптомы нарушения общего состояния были легкой степени проявления и по продолжительности были не более 2 сут. Из местных реакций чаще других регистрировалась болезненность в месте введения – у 71,2% волонтеров, гиперемия и припухлость в месте скарификации наблюдались у 99% и 96%, соответственно. Все местные и общие реакции были расценены как легкие и средней степени проявления. При анализе полученных данных установлено, что 2-этапный метод вакцинации вызывает ускорение развития кожных элементов на 3-4 дня по сравнению с обычным методом вакцинации.

Изучение уровня специфических антител в РБН и РТГА показало, что процент сероконверсий составил 100%, процент серопротекции – 98%. Среднегеометрический титр в РТГА составил (1,484078±0,03)lg, в РБН соответственно (2,804139±0,04)lg [5].

Таким образом, отработана технология получения вакцины оспенный инактивированной сухой – «ОспаВир» в ампулах по одной дозе. Антигенная активность полученной вакцины обеспечивает выработку вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации в титре не менее 1:80.

Результаты клинических испытаний свидетельствуют о низкой реактогенности и высокой иммунологической активности используемого метода вакцинации против натуральной оспы с применением на первом этапе инактивированной вакцины «Оспа-Вир».

В настоящее время вакцина «ОспаВир» в установленном порядке зарегистрирована и разрешена к медицинскому применению в Российской Федерации.

• 1.    Воробьев А.А., Боев Б.В., Бондаренко В.М., Гинц-бург А.Л.. Проблема биотерроризма в современных условиях // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2002. – № 3. – С. 3-12.

• 2.    Мацеевич Г.Р. Специфическая профилактика оспенной инфекции после отмены оспопрививания. // Автореф. дисс. … д-ра мед. наук. – М. 1983.

• 3.    Маренникова С.С., Мацеевич Г.Р., Соколова А.Ф. Отчет о ходе испытания двухэтапного метода вакцинации против оспы. – М. 1983.

• 4.    Методы контроля медицинских иммунологических препаратов, вводимых людям: Методические указания. – М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. – 128 с.

• 5.    Шкуратова О.В., Мовсесянц А.А., Перекрест В.В. и др. Клинические исследования инактивированной вакцины «ОспаВир» при двухэтапном методе вакцинации против натуральной оспы с применением на втором этапе живой оспенной вакцины // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – М. – 2006. – С. 108-109.

«OSPAVIR» IS A NEW PREPARATION

FOR PRIMARY VACCINATION AGAINST

VARIOLA

M.A. Gavrilova, O.V. Shkouratova, G.G. Maltseva, L.D. Bystritski, Ye.V. Rousavina

—#w---------------------