Отбор высокоиммуногенных штаммов ротавируса свиней, выделенных из тканей пораженных животных

Исследования показывают, что у свиней циркулируют различные генотипы ротавирусов, из которых типы A, B и C встречаются чаще всего.

Ротавирусы содержат сегментированный геном, состоящий из двухцепочечной РНК, что способствует частой генетической рекомбинации при коинфекции разными генотипами. Этот процесс приводит к появлению новых вариантов вируса с измененными антигенными свойствами, что снижает эффективность существующих вакцин и диагностических тестов [4, 5].

Ротавирусный энтерит поросят - серьезная и постоянная проблема свиноводческих комплексов во всем мире, одна из причин существенных экономических потерь [6, 7, 8].

Наибольшую опасность среди инфекционных болезней представляет ротавирусная инфекция и ее ассоциации с рядом других инфекций, протекающих нередко латентно, не-выявляемых своевременно, а потому бесконтрольно распространяющихся [9, 10, 11].

Наибольшее распространение получили модели мышей и свиней. Стоит отметить, что многие животные после первого инфицирования и переболевания становятся устойчивыми к повторному заражению [12, 13, 14].

Иммунная защита после перенесенной естественной РВ инфекции зависит от реинфекции, свойств вируса, иммунного статуса хозяина, а также продолжительности вирусного контакта [15, 16, 17].

Выделяемые гетеротипические антитела, способные нейтрализовать ротавирусы других типов, свидетельствуют о наличии антигенов с перекрестно-реактивными вируснейтрализую-щими эпитопами [18, 19, 20].

Цель исследований - отобрать высокоиммуногенные штаммы ротавируса свиней.

Проводили вирусологические исследования патологического материала от павших поросят с целью выделения возбудителя болезни. С этой целью осуществляли слепые пассажи суспензий патологического материала на перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиней (линия SPEV и РК-15), выращенной в среде МЕМ, содержащей 100 ед./см3 пенициллина и 100 мкг/см3 стрептомицина. Перед внесением суспензии монослой культуры клеток промывали 1 раз средой МЕМ. Адсорбцию суспензии проводили при температуре +37°С, затем вносили среду МЕМ, содержащую 0,5 мкг/см3 трипсина и антибиотики. Пенициллиновые флаконы инкубировали в термостате и каждые 2 сут. сравнивали с незара-женной культурой клеток для выявления ЦПД ротавируса. После пассажа обрабатывали трипсином и вновь пассировали на свежем монослое клеток SPEV и РК-15.

Оценку результатов роста перевиваемых линий культур клеток, зараженных изолятами ротавируса, проводили каждые 2 дня под световым микроскопом «Jenoval» с насадкой «C-45 k OPLENlG» при увеличении х10.

Промытый осадок культуры фиксировали по классической методике подготовки материала для электронной микроскопии: в эппен-дорфах с 1 %-ным раствором глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2).

После фиксации материал двукратно проводили через раствор 0,1 М фосфатного буфера для тщательного удаления глутарового альдегида. Далее проводили постфиксацию 1%-ным раствором тетраоксида осмия (OsO4) также на фосфатном буфере. Дегидратация была выполнена в спиртах восходящей концентрации (этиловый спирт – 30, 50, 70, 80, 96% – дважды, абсолютные спирты – дважды, ацетон - дважды).

Результаты и обсуждение. После заражения суспензиями патологического материала животных клеток SPEV и РК-15 в 1-2% случаев удалось добиться цитопатического эффекта, характерного для ротавируса. Он проявлялся округлением и деструкцией клеток, вакуолизацией и грануляцией цитоплазмы. После трех последовательных пассажей цитопатиче-ское действие было более выражено. Лучшую картину заражения показали клетки эпизоотических изолятов, выделенных из тканей легких, селезенки и кишечника больных поросят. Наиболее высокие разрушения клеток регистрировались в культурах, зараженных материалом из тканей кишечника в SPEV. Всего исследована 91 проба, в 16 из которых выявлено цитопатическое действие вируса, 8 проб оказались сомнительными, поэтому после инактивации были утилизированы.

Культуры клеток, зараженные суспензиями изолятов представлены на рисунках 1 -4.

Рисунок 1 – Культура клеток SPEV, третьего пассажа через 72 часа после зараженная суспензией из тканей легких, ЦПД 2 креста

Рисунок 2 - Культура клеток РК-15, третьего пассажа через 72 часа после зараженная суспензией из тканей кишечника, ЦПД 3 креста

Рисунок 3 - Культура клеток РК-15, седьмого пассажа через 96 часов после зараженная суспензией из тканей легких, ЦПД 3 креста

Рисунок 4 - Культура клеток SPEV, седьмого пассажа через 96 часов после зараженная суспензией из тканей легких, ЦПД 3 креста

На рисунках 5 и 6 представлены культуры

Рисунок 5 - Контроль SPEV

клеток без заражения.

Рисунок 6 - Контроль PK-15

После 7 пассажа титр вируса, выращенного в клетках SPEV, составлял 2,0 lg TЦД 50 /мл, в клетках РК-15 – 3,0 lg TЦД 50 /мл. Разрушенные клетки имели зернистую структуру, при незначительном встряхивании легко отделялись от поверхности стекла и в поддерживающей среде находились во взвешенном состоянии. Разрушение клеток монослоя регистрировалось по всей поверхности инкубационных флаконов.

Для идентификации ротавируса, 13 образцов с высоким титром антигенов, были исследованы в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. С этой целью были изготовлены олигонуклеотид-ные праймеры для амплификации генов ротавируса группы А: VP6 (Gene Bank ID OQ799805); VP4 (Gene Bank ID PV421650), VP7 (Gene Bank ID OQ743751), NSP2; группы B (Gene Bank ID KU562913) и группы С для VP6 (Gene Bank ID PRVVP6).

Полученные результаты ПЦР-анализа представлены на рисунках 7 и 8 и в таблице 1.

Рисунок 7 – Кривая накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM

^

Рисунок 8 – Кривая плавления ПЦР-продукта

Таблица 1 - Результаты ОТ-ПЦР по обнаружению генома ротавируса свиней

Образцы	Расположение на планшете	Канал флуоресценции	Пороговый цикл (C t )
ОКО	F11	FAM	N/A
14	E11	FAM	15,02
26	C11	FAM	16,35
27	D11	FAM	17,51
19	A11	FAM	22,64
23	B11	FAM	23,32
9	D02	FAM	26,99
8	C02	FAM	27,05
10	E02	FAM	27,97
15	H02	FAM	28,64
11	F02	FAM	30,94
6	A02	FAM	33,33
7	B02	FAM	35,52
12	G02	FAM	36,31
К	G11	FAM	–
К	H11	FAM	1

Из результатов таблицы 1 следует, что во всех исследуемых образцах в клетках перевиваемых линий РК-15 и SPEV обнаружена вирусная рибонуклеиновая кислота. Максимальный титр зарегистрирован в клетках РК-15, в образце из ткани кишечника, от поросенка из ООО «Камский Бекон», сигнал детектора по этому образцу зарегистрирован в 15 пороговом цикле (Ct) - 3*104-кратное (К) удвоение фрагмента РНК.

Провели иммуноферментный анализ антигенов в ИФА-тесте с использованием набора для выявления антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и ротавируса свиней (РВС) методом иммуноферментного

анализа (ИФА) от ООО «Ветбиохим» (г. Москва).

Учет результатов проводили на микроп-ланшетном ридере «Thermo Scientific» при длине волны 450 нм.

Установлено, что наиболее иммуногенными являлись образцы из селезенки, кишечник и легких.

Выводы . Проведенные методами ОТ-ПЦР и ИФА исследования подтвердили вирусоно-сительство ротавируса у свиней в Республиках Татарстан и Башкортостан. Вирусные изоля-ты, адаптированные к перевиваемым клеткам линий РК-15 и SPEV, использованы в разработке ротавирусной моновакцины.