Отбор высокоиммуногенных штаммов ротавируса свиней, выделенных из тканей пораженных животных
Автор: Плотникова Э.М., Ишмухаметов К.Т., Шакуров М.М., Мухаметшин И.Р., Гайнутдинов Т.Р.
Рубрика: Ветеринария
Статья в выпуске: 4 т.264, 2025 года.
Бесплатный доступ
Цель исследований – отобрать высокоиммуногенные штаммы ротавируса свиней. В качестве вируссодержащего материала использованы образцы патоматериала от павших поросят до 10-дневного возраста из неблагополучных по ротавирусной болезни свиней хозяйств Республик Башкортостан и Татарстан. Для выделения возбудителя использовали перевиваемые линии культур клеток РК-15 и SPEV. С этой целью осуществляли слепые пассажи суспензий патологического материала и вышеуказанных культур клеток. За период исследований было проведено 7 пассажей. С целью изучения биологических свойств, полученных изолятов, приведены исследования по оценке одного из важнейших биологических свойств вируса-цитопатического действия на поражаемые им животные клетки. Для этого в качестве биологической модели использовали культуры клеток (PK-15 и SPEV). Установлено, что в 6 из 32 отобранных образцов из тканей легких, селезенки и кишечника регистрировалось цитопатическое действие, которое было более выражено через 48-96 часов в 3 пассаже в виде округления и деструкции клеток, вакуолизации и грануляции цитоплазмы. После 7 пассажа клетки РК-15 и SPEV теряли способность удерживаться на стекле и в поддерживающей среде находились во взвешенном состоянии. Цитопатическое действие было более выражено при выделении вируса из тканей кишечника. Вирусная суспензия была заморожена при температуре – 60℃. Наличие рибонуклеиновой кислоты ротавируса подтверждено в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени и иммуноферментном анализе.
Ротавирусная болезнь свиней, эпизоотические изоляты, адаптация к культурам клеток, цитопатическое действие, инфекционная активность, полимеразная цепная реакция, иммуноферментный анализ
Короткий адрес: https://sciup.org/142246747
IDR: 142246747 | УДК: 619:613.73 | DOI: 10.31588/2413_4201_1883_4_264_71
Selection of highly immunogenic porcine rotavirus strains isolated from tissues of affected animals
The aim of the study was to select highly immunogenic porcine rotavirus strains. Virus-containing samples were collected from dead piglets up to 10 days old from farms affected by rotavirus disease in the Republics of Bashkortostan and Tatarstan. PK-15 and SPEV cell culture lines were used to isolate the pathogen. Blind passages of suspensions of pathological material and aforementioned cell cultures were performed. Seven passages were performed during the study period. To study the biological properties of the isolated cells, studies were conducted to evaluate one of the virus’s most important biological properties: its cytopathic effect on the animal cells it infects. Cell cultures (PK-15 and SPEV) were used as a biological model. It was found that 6 of 32 samples collected from lung, spleen and intestinal tissue exhibited a cytopathic effect, which was more pronounced after 48-96 hours in passage 3, manifested by cell rounding and destruction, vacuolization, and cytoplasmic granulation. After passage 7, PK-15 and SPEV cells lost their ability to adhere to glass and remained suspended in the maintenance medium. The cytopathic effect was more pronounced when the virus was isolated from intestinal tissue. The viral suspension was frozen at -60°C. The presence of rotavirus ribonucleic acid was confirmed by real-time reverse transcription polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay.
Текст научной статьи Отбор высокоиммуногенных штаммов ротавируса свиней, выделенных из тканей пораженных животных
Исследования показывают, что у свиней циркулируют различные генотипы ротавирусов, из которых типы A, B и C встречаются чаще всего.
Ротавирусы содержат сегментированный геном, состоящий из двухцепочечной РНК, что способствует частой генетической рекомбинации при коинфекции разными генотипами. Этот процесс приводит к появлению новых вариантов вируса с измененными антигенными свойствами, что снижает эффективность существующих вакцин и диагностических тестов [4, 5].
Ротавирусный энтерит поросят - серьезная и постоянная проблема свиноводческих комплексов во всем мире, одна из причин существенных экономических потерь [6, 7, 8].
Наибольшую опасность среди инфекционных болезней представляет ротавирусная инфекция и ее ассоциации с рядом других инфекций, протекающих нередко латентно, не-выявляемых своевременно, а потому бесконтрольно распространяющихся [9, 10, 11].
Наибольшее распространение получили модели мышей и свиней. Стоит отметить, что многие животные после первого инфицирования и переболевания становятся устойчивыми к повторному заражению [12, 13, 14].
Иммунная защита после перенесенной естественной РВ инфекции зависит от реинфекции, свойств вируса, иммунного статуса хозяина, а также продолжительности вирусного контакта [15, 16, 17].
Выделяемые гетеротипические антитела, способные нейтрализовать ротавирусы других типов, свидетельствуют о наличии антигенов с перекрестно-реактивными вируснейтрализую-щими эпитопами [18, 19, 20].
Цель исследований - отобрать высокоиммуногенные штаммы ротавируса свиней.
Проводили вирусологические исследования патологического материала от павших поросят с целью выделения возбудителя болезни. С этой целью осуществляли слепые пассажи суспензий патологического материала на перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиней (линия SPEV и РК-15), выращенной в среде МЕМ, содержащей 100 ед./см3 пенициллина и 100 мкг/см3 стрептомицина. Перед внесением суспензии монослой культуры клеток промывали 1 раз средой МЕМ. Адсорбцию суспензии проводили при температуре +37°С, затем вносили среду МЕМ, содержащую 0,5 мкг/см3 трипсина и антибиотики. Пенициллиновые флаконы инкубировали в термостате и каждые 2 сут. сравнивали с незара-женной культурой клеток для выявления ЦПД ротавируса. После пассажа обрабатывали трипсином и вновь пассировали на свежем монослое клеток SPEV и РК-15.
Оценку результатов роста перевиваемых линий культур клеток, зараженных изолятами ротавируса, проводили каждые 2 дня под световым микроскопом «Jenoval» с насадкой «C-45 k OPLENlG» при увеличении х10.
Промытый осадок культуры фиксировали по классической методике подготовки материала для электронной микроскопии: в эппен-дорфах с 1 %-ным раствором глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2).
После фиксации материал двукратно проводили через раствор 0,1 М фосфатного буфера для тщательного удаления глутарового альдегида. Далее проводили постфиксацию 1%-ным раствором тетраоксида осмия (OsO4) также на фосфатном буфере. Дегидратация была выполнена в спиртах восходящей концентрации (этиловый спирт – 30, 50, 70, 80, 96% – дважды, абсолютные спирты – дважды, ацетон - дважды).
Результаты и обсуждение. После заражения суспензиями патологического материала животных клеток SPEV и РК-15 в 1-2% случаев удалось добиться цитопатического эффекта, характерного для ротавируса. Он проявлялся округлением и деструкцией клеток, вакуолизацией и грануляцией цитоплазмы. После трех последовательных пассажей цитопатиче-ское действие было более выражено. Лучшую картину заражения показали клетки эпизоотических изолятов, выделенных из тканей легких, селезенки и кишечника больных поросят. Наиболее высокие разрушения клеток регистрировались в культурах, зараженных материалом из тканей кишечника в SPEV. Всего исследована 91 проба, в 16 из которых выявлено цитопатическое действие вируса, 8 проб оказались сомнительными, поэтому после инактивации были утилизированы.
Культуры клеток, зараженные суспензиями изолятов представлены на рисунках 1 -4.
Рисунок 1 – Культура клеток SPEV, третьего пассажа через 72 часа после зараженная суспензией из тканей легких, ЦПД 2 креста
Рисунок 2 - Культура клеток РК-15, третьего пассажа через 72 часа после зараженная суспензией из тканей кишечника, ЦПД 3 креста
Рисунок 3 - Культура клеток РК-15, седьмого пассажа через 96 часов после зараженная суспензией из тканей легких, ЦПД 3 креста
Рисунок 4 - Культура клеток SPEV, седьмого пассажа через 96 часов после зараженная суспензией из тканей легких, ЦПД 3 креста
На рисунках 5 и 6 представлены культуры
Рисунок 5 - Контроль SPEV
клеток без заражения.
Рисунок 6 - Контроль PK-15
После 7 пассажа титр вируса, выращенного в клетках SPEV, составлял 2,0 lg TЦД 50 /мл, в клетках РК-15 – 3,0 lg TЦД 50 /мл. Разрушенные клетки имели зернистую структуру, при незначительном встряхивании легко отделялись от поверхности стекла и в поддерживающей среде находились во взвешенном состоянии. Разрушение клеток монослоя регистрировалось по всей поверхности инкубационных флаконов.
Для идентификации ротавируса, 13 образцов с высоким титром антигенов, были исследованы в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. С этой целью были изготовлены олигонуклеотид-ные праймеры для амплификации генов ротавируса группы А: VP6 (Gene Bank ID OQ799805); VP4 (Gene Bank ID PV421650), VP7 (Gene Bank ID OQ743751), NSP2; группы B (Gene Bank ID KU562913) и группы С для VP6 (Gene Bank ID PRVVP6).
Полученные результаты ПЦР-анализа представлены на рисунках 7 и 8 и в таблице 1.
Рисунок 7 – Кривая накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM
^
Рисунок 8 – Кривая плавления ПЦР-продукта
Таблица 1 - Результаты ОТ-ПЦР по обнаружению генома ротавируса свиней
|
Образцы |
Расположение на планшете |
Канал флуоресценции |
Пороговый цикл (C t ) |
|
ОКО |
F11 |
FAM |
N/A |
|
14 |
E11 |
FAM |
15,02 |
|
26 |
C11 |
FAM |
16,35 |
|
27 |
D11 |
FAM |
17,51 |
|
19 |
A11 |
FAM |
22,64 |
|
23 |
B11 |
FAM |
23,32 |
|
9 |
D02 |
FAM |
26,99 |
|
8 |
C02 |
FAM |
27,05 |
|
10 |
E02 |
FAM |
27,97 |
|
15 |
H02 |
FAM |
28,64 |
|
11 |
F02 |
FAM |
30,94 |
|
6 |
A02 |
FAM |
33,33 |
|
7 |
B02 |
FAM |
35,52 |
|
12 |
G02 |
FAM |
36,31 |
|
К |
G11 |
FAM |
– |
|
К |
H11 |
FAM |
1 |
Из результатов таблицы 1 следует, что во всех исследуемых образцах в клетках перевиваемых линий РК-15 и SPEV обнаружена вирусная рибонуклеиновая кислота. Максимальный титр зарегистрирован в клетках РК-15, в образце из ткани кишечника, от поросенка из ООО «Камский Бекон», сигнал детектора по этому образцу зарегистрирован в 15 пороговом цикле (Ct) - 3*104-кратное (К) удвоение фрагмента РНК.
Провели иммуноферментный анализ антигенов в ИФА-тесте с использованием набора для выявления антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и ротавируса свиней (РВС) методом иммуноферментного
анализа (ИФА) от ООО «Ветбиохим» (г. Москва).
Учет результатов проводили на микроп-ланшетном ридере «Thermo Scientific» при длине волны 450 нм.
Установлено, что наиболее иммуногенными являлись образцы из селезенки, кишечник и легких.
Выводы . Проведенные методами ОТ-ПЦР и ИФА исследования подтвердили вирусоно-сительство ротавируса у свиней в Республиках Татарстан и Башкортостан. Вирусные изоля-ты, адаптированные к перевиваемым клеткам линий РК-15 и SPEV, использованы в разработке ротавирусной моновакцины.
