Ответная реакция культивируемых in vitro клеток Linum grandiflorum Desf. на действие кадмия и глифосата

Одна из проблем современности — изменение экологической обстановки вследствие активной промышленной и сельскохозяйственной деятельности человека. Происходит техногенное загрязнение окружающей среды различными поллютантами, в том числе тяжелыми металлами (1). К наиболее распространенным относится кадмий, который в 2-20 раз токсичнее для растений, животных и человека, чем другие металлы (2). Cd оказывает негативное действие на процессы фотосинтеза и дыхания, водный режим, минеральное питание, функционирование антиоксидантной системы. Кадмий повреждает светособирающие антенные комплексы фотосистемы I и фотосистемы II (3, 4), конкурирует с ионом аммония, тем самым влияя на азотный метаболизм (5), способствует активации свободно-радикальных процессов (6), изменяет накопление различных антиоксидантов (7, 8). Все это приводит к нарушению естественных растительных сообществ, а у культурных видов — к значительным потерям урожая, обусловленным изменениями в росте и развитии (1).

В современных агроэкологических условиях существует проблема засорения посевов полевых и декоративных культур сорными травами, для решения которой широко применяются гербициды, способные подавлять рост растений (9). К их числу относится глифосат (N-(фосфонометил)-глицин) — послевсходовый неселективный гербицид системного действия, занимающий первое место в мире по производству среди препаратов аналогичного действия (10). Глифосат — уникальный ингибитор ключевого фермента шикиматного пути биосинтеза ароматических соединений 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, вследствие чего у растений подавляется синтез белков и вторичных метаболитов фенольной природы, а также отмечается дерегуляция энергетического обмена (11).

Фенольные соединения относятся к веществам вторичного метаболизма, синтезирующимся во всех клетках и тканях растений (12). Они значительно различаются по структуре, химическим свойствам и биологической активности. Их функциональная роль разнообразна и связана с процессами фотосинтеза, дыхания, регуляции ферментативной активности, защиты клеток от стрессовых воздействий (13). Антиоксидантные свойства этих растительных метаболитов обусловлены наличием в их структуре гидроксильных групп, которые легко взаимодействуют со свободными радикалами, тем самым способствуя ингибированию процессов радикально-цепного окисления в условиях стрессовых воздействий (14).

Лен (класс Dicotyledoneae , сем. Linaceae ) — одна из важнейших культур комплексного использования (15). Он характеризуется многообразием видовых групп и разновидностей, что открывает широкие возможности его использования в аграрной, текстильной и фармацевтической промышленности, а также в декоративно-ландшафтном земледелии (16, 17). В последнем случае все успешнее используют однолетний декоративный вид льна Linum grandiflorum Desf. (лен крупноцветковый), у которого хорошо развита вегетативная часть и цветение продолжается до осени (18). Поскольку эту культуру высаживают на городских территориях, где почвы и окружающая среда загрязнены поллютантами, а для борьбы с сорняками применяются различные гербициды, целесообразно изучить ее устойчивость к их воздействию.

Метод культивирования клеток и тканей растений in vitro позволяет исследовать метаболические процессы, а также ответную реакцию клеток на действие стрессовых факторов на более простом по сравнению с интактным растением уровне организации (19, 20). Выращивание льна в культуре in vitro имеет длительную историю. При этом сохранение биоразнообразия, изучение структуры растительных клеток и их устойчивости к стрессовым факторам (21-23) были основными направлениями исследований. Но в целом работ по L. grandiflorum крайне мало, и в них преимущественно рассматриваются вопросы морфогенеза, получения эмбриокультур, изучения резистентности клеточных линий (24, 25).

В настоящем исследовании нами впервые выявлены различия в реакции in vitro культивируемых клеток льна крупноцветкового на действие таких стрессовых факторов, как поллютант (кадмий) и гербицид (гли- фосат). Это проявляется как в морфофизиологических характеристиках, так и при биосинтезе фенольных соединений — веществ с высокой биологической и антиоксидантной активностью.

Целью нашей работы была оценка ростовой активности каллусной культуры льна крупноцветкового и накопления в ней фенольных соединений, в том числе фенилпропаноидов и флавоноидов, а также реакции культуры на действие поллютанта (кадмия) и гербицида (глифосата).

Методика. Каллусные культуры льна крупноцветкового, выращивали на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 2 % сахарозы и 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в факторостатной камере (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Россия) при температуре 25 °С, относительной влажности воздуха 70 % и 16-часовом фотопериоде (интенсивность освещения 5000 лк).

При изучении влияния стрессоров в основную питательную среду добавляли кадмий Cd(NO3)2 (60 мкМ), глифосат («Monsanta», Бельгия) (10 мкМ) или кадмий и глифосат одновременно (в тех же концентрациях). Контролем была обычная питательная среда. Каллусные культуры анализировали в конце пассажа (28-е сут культивирования), фиксируя их жидким азотом для последующих биохимических исследований. Учитывали интенсивность роста каллусов и их морфофизиологические характеристики. Содержание воды в каллусных тканях определяли стандартным методом после высушивания до постоянной массы в термостате при 70 °С (26).

Фенольные соединения извлекали 96 % этанолом из замороженного жидким азотом растительного материала при -196 °С. Через 45 мин гомогенат центрифугировали (16000 об/мин, 15 мин) и надосадочную жидкость использовали для спектрофотометрических исследований. Содержание суммы растворимых фенольных соединений определяли с реактивом Фолина-Дениса, флавоноидов — с 1 % раствором AlCl3 при X = 725 нм и X = 415 нм (27). Калибровочные кривые строили по рутину. Количество фенилпропаноидов оценивали прямой спектрофотометрией экстрактов при X = 330 нм, используя кофейную кислоту для построения калибровочной кривой (28).

Для изучения состава фенольного комплекса каллусных культур льна применяли метод тонкослойной хроматографии на пластинках с целлюлозой («Merck KGaA», Германия), растворитель БУВ (н-бутанол + уксусная кислота + вода в соотношении 40:12:28). Предварительную идентификацию фенольных соединений проводили на ультрахемископе DESAGA UVIS («DESAGA», Голландия) по специфической ярко-голубой или синей флуоресценции в УФ-свете при X = 254 нм и X = 366 нм. Для обнаружения фенольных соединений хроматограммы обрабатывали смесью 1 % растворов FeCl₃ и K₃Fe(CN) 6 (1:1), а также использовали реагент на фенолкарбоновые кислоты (диазотированный п-нитроанилин, с последующей обработкой 20 % раствором Na₂CO₃) (27).

Эксперименты проводили в 5-кратных биологических и 3-кратных аналитических повторностях. Корреляционный и факторный (ANOVA) анализ осуществляли в программе SigmaPlot 12.3 . В таблицах представлены средние арифметические значения полученных величин (М) и их стандартные ошибки (±SEM). Надстрочные символы обозначают статистическую значимость различий средних значений по тесту Тьюки при p < 0,05.

Результаты . Каллусная культура льна крупноцветкового, выращенная на основной питательной среде, имела преимущественно желтый цвет, хотя некоторые участки были светло-зелеными (рис. 1, А). Это мо-940

жет свидетельствовать о начальных этапах формирования в ней хлоропла- стов, поскольку рост происходил при световом воздействии. О том, что в культурах in vitro формируются эти органеллы, сообщалось в литературе (19). Следует также отметить, что каллусы льна имели рыхлую структуру, низкий прирост в течение всего пассажа и высокую оводненность (табл. 1). Аналогичные характеристики каллусной культуры льна крупноцветко- вого приводились и другими авторами (24).

А

Б

Рис. 1. Внешний вид каллусной культуры льна крупноцветкового ( Linum grandiflorum Desf.), выращенной на основной питательной среде (А) , а также на питательной среде с кадмием (60 мкМ) (Б) , глифосатом (10 мкМ) (В) , кадмием и глифосатом (Г) (возраст 28 сут).

Известно, что в условиях in vitro клетки растений сохраняют многие свойства интактных тканей, в том числе способность к синтезу фенольных соединений (19, 20). По мере роста каллусной культуры льна крупноцветкового содержание суммы фенольных соединений повышалось (см. табл. 1). Наиболее значительные изменения происходили с 6-х по 14-е сут культивирования, когда количество фенольных соединений возрастало в 2,4 раза. Максимальное суммарное содержание отмечали в конце пассажа — в 2,7 раза больше по сравнению с начальными этапами роста (6-е сут). Следовательно, наибольшая интенсивность биосинтеза феноль- ных соединений была приурочена к первой половине цикла роста культуры, что еще раз подтверждает высокую способность молодых клеток растений к образованию этих метаболитов (12).

1. Морфофизиологические и биохимические характеристики каллусной культуры льна крупноцветкового ( Linum grandiflorum Desf.) на основной питательной среде в течение пассажа ( M ±SEM)

Показатель	Возраст культуры, сут
	6 1	14	28
Прирост каллусной массы, %	115±5А	125±6А	150±5В
Оводненность, % Суммарное содержание фенольных соединений,	94,42±0,48А	97,27±1,24А	97,254±1,01А
мг-экв. рутина/г сухой массы Содержание фенилпропаноидов, мг-экв. кофейной	7,43±0,31А	18,07± 0,92В	20,23±0,74В
кислоты/г сухой массы	10,58±0,63А	24,60±0,65В	28,97±0,54В
Содержание флавоноидов, мг-экв. рутина/г сухой массы	2,92±0,74А	6,56±0,86В	6,03±0,71В
П р и м е ч а н и е. Надстрочные символы (А, В) обозначают достоверность различий средних значений по тесту Тьюки при p < 0,05.

Фенилпропаноиды — биогенетически ранние представители фенольных соединений, синтезирующиеся в тканях растений (12). Сообщалось об их накоплении у различных представителей рода Linum (29). Тенденция накопления фенилпропаноидов в каллусах льна крупноцветкового была аналогична таковой для суммы фенольных соединений (см. табл. 1).

Исходя из этого, можно предположить, что они служат основными компонентами фенольного комплекса культур и определяют характер накопления фенольных соединений.

Флавоноиды — одни из наиболее распространенных в растительных тканях представителей фенольного метаболизма (12). Их накопление в культурах каллусов возрастало в первой половине цикла культивирования и к 14-м сут в 2,25 раза превышало аналогичный показатель у 6-суточной культуры. К концу пассажа содержание флавоноидов незначительно снижалось, но оставалось выше, чем в начале пассажа (почти в 2 раза). То есть на завершающих этапах роста культуры, а именно во время стационарной фазы, отмечалась тенденция к уменьшению содержания этих метаболитов, что характерно и для тканей растений (13).

Воздействие таких стрессовых факторов, как кадмий и глифосат, приводит к повышению образования в клетках активных форм кислорода (2, 11). В этих условиях важная роль принадлежит фенольным соединениям — низкомолекулярным компонентам антиоксидантной системы защиты (14, 31). Они способны «прерывать» цепные реакции окисления, вызванные стрессовыми факторами, а также образовывать комплексы с тяжелыми металлами, предотвращая их токсическое действие (1). В связи с этим нашей следующей задачей стало изучение действия кадмия и глифосата на рост каллусных культур льна крупноцветкового, а также накопление в них фенольных соединений, которое оценивалось в конце пассажа, то есть в период их максимального накопления.

2. Морфофизиологические и биохимические характеристики каллусной культуры льна крупноцветкового ( Linum grandiflorum Desf.) на средах с кадмием (60 мкМ) и глифосатом (10 мкМ) ( M ±SEM, возраст 28 сут)

Показатель	Стрессовый фактор
	кадмий	глифосат кадмий + глифосат
Прирост каллусной массы, %                           135±7А      165±8В          150±6В Оводненность, %                                       97,20±1,01А 95,90±1,01А      97,71±1,12А Суммарное содержание фенольных соединений, мг-экв. рутина/г сухой массы                           19,45±0,36А 15,93±0,72А      25,23±0,94В Содержание фенилпропаноидов, мг-экв. кофейной кислоты/г сухой массы                                 30,22±0,74А 27,68±0,63А      15,46±0,34В Содержание флавоноидов, мг-экв. рутина/г сухой массы  6,38±0,71А  3,48±0,29В       2,77±0,14В П р и м еч а ни е. Надстрочные символы (А, В) обозначают достоверность различий средних значений по тесту Тьюки при p < 0,05.

Каллусная культура, выращенная на питательных средах с добавлением кадмия и глифосата, имела светло-желтый цвет (см. рис. 1, Б-Г). Отмечалось ее незначительное позеленение, но в меньшей степени, чем в контрольном варианте. Кроме того, на поверхности формировались небольшие темно-коричневые участки, что могло свидетельствовать о некротизации клеток, характерной и для других культур in vitro в присутствии кадмия (30). При этом морфофизиологические характеристики каллусов, выращиваемых на среде с глифосатом, были лучше, чем в контрольном варианте. Они оказались более плотными и компактными, желтоватозеленого цвета, с хорошим приростом (табл. 2). Содержание воды в культурах во всех опытных вариантах имело близкие значение, примерно равные таковым в контроле.

Наличие кадмия в среде практически не влияло на биосинтетическую способность каллусных культур (см. табл. 2). Суммарное накопление фенольных соединений, количество фенилпропаноидов и флавоноидов были сходными с аналогичными показателями в контроле (см. табл. 1). По всей видимости, клетки L. grandiflorum устойчивы к действию изученной концентрации металла. Это может быть следствием принадлежности 942

льна к группе растений-аккумуляторов, у которых токсическое действие металла выражено при более высоких концентрациях поллютанта по срав

Рис. 2. Хроматографическое разделение этанольных экстрактов из каллусных культур льна крупноцветкого ( Linum grandiflorum Desf.), выращенных на основной питательной среде (К) и на средах с кадмием (Cd) , глифосатом (Гл) и их сочетанием (Cd + Гл) : 1-8 — обнаруженные вещества фенольной природы. Тонкослойная хроматография на пластинках с целлюлозой, состав растворителя (БУВ) — н-бутанол + уксусная кислота + вода (40:12:28). Указаны значения Rf (отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному растворителем).

нению с другими культурами, являющимися преимущественно исклю-чателями, накапливающими тяжелые металлы в корневой системе (1).

Глифосат служит ингибитором одного из ферментов фенольного метаболизма, ответственных за начальные этапы биосинтеза этих вторичных метаболитов (10). При его поступлении в растения в ряде случаев отмечалось уменьшение их накопления (31). В нашем опыте наблюдалась аналогичная тенденция, особенно в отношении флавоноидов (см. табл. 2). Можно предположить, что глифосат ингибировал преимущественно флавоноидный путь биосинтеза фенольных соединений и в значительно меньшей степени — фенил-пропаноидный.

Наиболее выраженное влияние на накопление фенольных соединений в каллусных культурах отмечали при комплексном воздействии кадмия и глифосата. В этом случае значительно возрастало суммарное содержание фенольных соединений на фоне снижения количества фенил-пропаноидов и флавоноидов, что предполагает активацию образования других классов фенольных соединений, в частности лигнанов — соединений фенольной природы, характерных для растений льна (29).

Для понимания особенностей образования фенольных соединений в клетках растений важно изучать не только их содержание, но и состав (12).

3. Состав фенольного комплекса этанольных экстрактов каллусных культур льна крупноцветкового ( Li-num grandiflorum Desf.) в контрольном и всех опытных вариантах (среда Мурасиге-Скуга)

¹ фракции	Rf	I                     1	II
1	0,28	+	+
2	0,35	+	-
3	0,53	+	+
4	0,59	+	+
5	0,62	+	+
6	0,70	+	+
7	0,75	+	+
8	0,89	+	+

П р и м е ч а н и е. Для разделения использовали тонкослойную хроматографию на пластинках с целлюлозой, растворитель н-бутанол + уксусная кислота + вода (40:12:28). Rf — отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному растворителем, I и II — проявление реактивом соответственно на фенольные соединения и фенилпропаноиды.

Мы использовали метод тонкослойной хроматографии, который не выявил различий в составе комплекса экстрагируемых этанолом фенольных соединений в контрольном и опытных вариантах (рис. 2, табл. 3). Во всех экстрактах присутствовали 8 соединений фенольной природы, из которых три доминировали. Большинство феноль- ных соединений, судя по их подвижности, были конъюгатами фенолкарбоновых кислот — п-оксибензойнаой (соединения 1, 6, 8), п-кумаровой (соединения 3, 7), феруловой (соединение 4) и кофейной (соединение 5) (27). О наличии этих веществ в фенольном комплексе растений льна сообщалось и другими авторами (29, 30). Поскольку тонкослойная хроматография позволяет лишь предварительно оценить состав фенольного комплекса растительных клеток и тканей и не дает полной картины, эти исследования будут в дальнейшем продолжены.

Таким образом, культивируемые в условиях in vitro клетки льна крупноцветкового обладают способностью к образованию фенольных соединений — биологически активных веществ с антиоксидантной активностью, наибольшее накопление которых отмечалось в конце цикла культивирования. Их содержание быстро увеличивалось в первой половине цикла, достигая наибольших значений к концу пассажа, что может служить доказательством важности образования фенольных соединений, в том числе фенилпропаноидов и флавоноидов, в растительных клетках не только в условиях in vivo, но и in vitro. Тяжелый металл кадмий при добавлении в среду культивирования влиял на морфофизиологические характеристики каллусной культуры, однако изменений в накоплении фенольных соединений, включая фенилпропаноиды и флавоноиды, не наблюдалось. Это еще раз подтверждает значительную устойчивость клеток льна к действию тяжелых металлов. Присутствие в среде гербицида глифосата снижало способность культуры льна крупноцветкового к накоплению фенольных соединений, что в большей степени проявлялось в отношении флавоноидов. При комплексном действии двух этих факторов суммарное содержание фенольных соединений в культурах повышалось, а количество фенилпропаноидов и особенно флавоноидов — снижалось, что может быть следствием образования других представителей фенольных соединений. Полученные нами данные еще раз подтверждают видоспецифичность реакции клеток растений на действие стрессовых факторов.