Патоморфологические и функциональные изменения в ишемизированном спинном мозге крыс после применения рекомбинантного эритропоэтина

Введение. Рядом авторов показано, что развитие некроза в зоне ишемии спинного мозга (СМ) можно избежать с помощью реперфузии и применения нейропротективных препаратов, в частности под воздействием альфа-GPC, церебролизина, пи-роцетама, винпоцетина [1]. В то же время эффективность нейромедиаторной терапии ишемических повреждений ЦНС после введения указанных препаратов является различной и остаётся невысокой, что диктует необходимость поиска новых методов лечения данной патологии.

В связи с этим, в последние годы большой интерес вызывает рекомбинантный эритропоэтин (РЭП), как средство базисной терапии хронической почечной недостаточности, плейотропные эффекты которого являются объектом пристального внимания исследователей различных специальностей. В частности, установлены нейропротек-торные свойства рекомбинантного эритропоэтина, связанные с антиапоптотическим и антигипокси-ческим действиями [4, 6–8]. Показано, что плейо-тропные эффекты РЭП реализуются за счёт наличия специфических рецепторов на различных клетках, в том числе на нейронах [5]. Поэтому выяснение возможной патогенетической роли РЭП в коррекции ишемических нарушений в СМ представляется весьма перспективным и актуальным исследованием.

Цель работы : исследование динамики пато-морфологических и функциональных изменений в ишемизированной области СМ крыс под воздействием РЭП.

Материалы и методы. Работа выполнена на 40 беспородных половозрелых крысах обоего пола линии «Вистар» массой 220–250 г. Животные содержались в условиях вивария, регламентируемых приказом МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 г. Опыты проводили в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.09.1977 г. и № 701 от 27.07.1978 г. об обеспечении принципов гуманного обращения с животными. Все оперативные вмешательства проводились в экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики под внутримышечным обезболиванием препаратом золитил (2 мг/кг массы тела животного). Выведение животных из эксперимента осуществлялось путём внутрисердечного введения 3 мл 7,5 % раствора хлористого калия. Все животные были разделены на 2 серии опытов.

В первой серии экспериментов на 20 животных (группа сравнения) моделировали ишемию СМ по методике, предложенной Г.З. Суфиановой и др. [3]. Транзиторную ишемию поясничного отдела СМ создавали путём тотальной интравазаль-ной окклюзии и последующим клипированием бедренных артерий. С этой целью в обе бедренные артерии по направлению к сердцу вводили окклю-деры (стерильную нить из хромированного кетгута 3.0), глубину введения которых определяли расстоянием от мечевидного отростка до основания хвоста. Через 45 мин окклюдеры извлекали, а бедренные артерии затем клипировали. Животных выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.

Во второй серии эксперимента на 20 животных моделировали ишемию СМ, по методике описанной выше (1-я серия эксперимента). Через 3 ч после операции каждому животному вводили внутрибрюшинно 1000 МЕ РЭП («ЭПОКРИН 2000 МЕ») из расчёта 5000 МЕ на 1 кг массы тела животного по международному протоколу. Затем введение препарата повторяли через 24 и 48 ч по 1000 МЕ после создания ишемии. Выведение животных из опыта осуществляли на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.

После выведения животных из экспериментов СМ извлекали и фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах с возрастающей концентрацией и заливали в парафины. С парафиновых блоков готовили серийные фронтальные срезы толщиной 3–5 мкм. Серийные срезы СМ окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Бильшовского для выявления миелиновых волокон, по методу Ниссля для верификации-тигроидного вещества Ниссля, глиальных клеток. Морфометрические исследования проводили с помощью компьютерной программы анализа цветового изображения «ДиаМорфCito-W» (Россия) при увеличении микроскопа ×400 в десяти случайно отобранных полях зрения. Подсчитывали на условной единице площади количество нормальных нейронов, нейронов с хроматолизом, клеток-теней, мелких кровеносных сосудов (капилляров, артериол).

с признаками их гипертрофии, наблюдалась активизация микроглии, появлялись макрофаги.

Результаты количественного исследования препаратов СМ показали, что число нормальных нейронов на 7-е сут опыта существенно уменьшилось, а нейронов с хроматолизом, клеток-теней и глиальных клеток – увеличилось по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. На 14-е сут количество нормальных нейронов, а также содержание глиальных клеток и кровеносных сосудов на 30-е сут достоверно увеличилось по отношению к предыдущим срокам эксперимента (табл. 2).

При исследовании гистологических препаратов СМ животных на 3-и и 7-е сут опыта, а также в последующие сроки наблюдения (14-е, 30-е сут) отмечалась хорошая сохранность нейронов, среди

Таблица 1

Шкала оценки поведенческих реакций у крыс по интегральному показателю в баллах [2]

Критерий оценки

Балл

Отсутствие двигательной активности и рефлекса позы Отсутствие двигательной активности и реакции на раздражитель задних конечностей и хвоста, но сохранение рефлекса позы Двигательная активность только за счет передних конечностей, слабая реакция на раздражитель задних конечностей и хвоста Имитация восстановления функции одной из задних конечностей Имитация восстановления функции обеих конечностей Восстановление функции задних конечностей, но сниженная реакция на тепловой раздражитель (более 8 с) Восстановление скорости реакции на тепловой раздражитель (8 с и менее)

0 1 2 3 4 5 6

Количественную оценку состояния и поведения животных проводили по интегральному показателю в баллах (табл. 1), предложенному С.С. Пашиным и И.В. Викторовым [2].

Полученные результаты обрабатывали с помощью лицензионного пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoftIns, USA). Применялись методы вариационной статистики. Статистическая значимость различий сравниваемых признаков в группах оценивалась с использованием непараметрического U-теста Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне P < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение. При гистологическом исследовании препаратов поясничного утолщения СМ у крыс 1-й серии опытов на третьи сутки наиболее выраженные изменения отмечались в передних рогах – хроматолиз цитоплазмы, пикноз ядер, растворение глы-бокбазофильного вещества Ниссля в нейронах с превращением их в клетки-тени. Встречались неизменённые и гиперхромные нейроны, отмечалась нейронофагия, перицеллюлярный и периваскулярный отёк в белом веществе.

Морфологические изменения в тканях СМ на 7, 14, 30-е сутки опытов были сходными. В центральной зоне ишемического очага определялись деструктивные изменения в нейронах, а в перифокальной зоне отмечались также неповреждённые нейроны. Увеличивалось содержание астроцитов которых встречались отдельные гиперхромные клетки и лишь единичные были с признаками набухания и сморщивания. Определялась активная пролиферация глиоцитов и эндотелиоцитов капилляров, артериол. Это свидетельствовало о слабо выраженных ишемических повреждениях, без формирования зоны некроза в тканях СМ.

Результаты морфометрического исследования препаратов СМ показали (табл. 2), что содержание нормальных нейронов, в зависимости от предыдущих сроков наблюдения увеличивалось незначительно, за исключением 7-х сут, а число нейронов с хроматолизом на 7, 14, 30-е сут существенно уменьшалось. Наряду с этим, число клеток-теней достоверно уменьшалось, начиная с 7-х сут. Коли-чествоглальных клеток и кровеносных сосудов значительно увеличивалось на 7-е и 30-е сут. Кроме того, содержание нормальных нейронов, глиальных клеток и кровеносных сосудов было значительно больше, а число нейронов с хроматолизом и клеток-теней – меньше на всех сроках экспериментов по сравнению с 1-й серией опыта (группа сравнения).

Результаты исследования показали, что ишемическое повреждение поясничного утолщения СМ приводит к выраженным нарушениям моторных функций, о чем наглядно свидетельствует динамика изменений интегрального показателя поведенческих реакций в разные сроки наблюдения

Проблемы здравоохранения

Таблица 2

Динамика количественных изменений клеточных элементов и мелких кровеносных сосудов в ишемизированных тканях СМ крыс 1-и и 2-й серий опытов (на условной единице площади М ± m)

Исследованный показатель	Серия опыта	Срок наблюдения (сут)
		3-и	7-е	14-е	30-е
Количество нормальных	1-я	30,2 ± 2,1	24,3 ± 1,1 *	27,8 ± 1,3 *	29,9 ± 2,5
нейронов	2-я	69,3 ± 3,1 **	81,8 ± 2,8 *-**	87,7 ± 2,5 **	90,8 ± 3,5 **
Число нейронов	1-я	29,3 ± 0,6	36,4 ± 0,9 *	43,6 ± 2,1 *	53,8 ± 1,2 *
с хроматолизом	2-я	25,2 ± 0,4 **	20,1 ± 0,8 *'**	17,1 ± 0,5 *’**	12,2 ± 0,3 *’**
Число	1-я	36,2 ± 2,3	58,1 ± 2,5 *	63,8 ± 2,8	67,9 ± 2,2
клеток-теней	2-я	15,2 ± 0,3 **	10,1 ± 0,2 *,**	8,3 ± 0,4 *’**	3,8 ± 0,5 *’**
Количество	1-я	92,3 ± 1,9	115,5 ± 2,1*	123,4 ± 2,2 *	112,2 ± 1,9 *
глиальных клеток	2-я	124,7 ± 2,2 **	135,8 ± 3,2 *’**	143,9 ± 3,1 **	156,8 ± 3,4 *’**
Количество мелких кровеносных	1-я 2-я	4,3 ± 0,2	6,2 ± 0,4	8,1 ± 0,7	10,2 ± 0,6 *
сосудов		7,9 ± 0,1 **	11,9 ± 0,2 *’**	16,8 ± 0,5 *’**	17,3 ± 0,3 **

Примечание. 1-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга (группа сравнения); 2-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга, леченная РЭП; * - p < 0,05 по сравнению с предыдущим сроком опыта в каждой серии; ** - p < 0,05 по отношению к 1-й серии опыта.

(табл. 3). В то же время применение РЭП способствует достоверному увеличению интегрального показателя.

Таблица 3 Динамика изменений интегрального показателя поведенческих реакций в первой и второй группах опытов (М ± m)

Серия опыта	Сроки наблюдения (сут)
	3-и	7-е	14-е	30-е
1-я 2-я	0,9 ± 0,4 5,2 ± 0,4 *	1,5 ± 0,6 5,5 ± 0,5 *	2,6 ± 0,7 5,7 ± 0,4 *	2,9 ± 0,5 5,8 ± 0,3 *

Примечание. 1-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга (группа сравнения); 2-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга, леченная РЭП; * - p < 0,05 по сравнению с 1-й серией опыта.

Таким образом, результаты проведенного экспериментального исследования показали, что использование для лечения ишемических поражений спинного мозга РЭП увеличивает толерантность нейронов к гипоксическому повреждению. Данные изменения можно объяснить тем, что РЭП обладает антиапоптотическим и антигипоксическим действием, стимулирует ангио- и нейрогенез [4, 6-8].

Заключение. Результаты исследования свидетельствуют, что применение РЭП, как одного из способов лечения экспериментальной ишемии спинного мозга у крыс, способствует на ранних сроках наблюдения значительному предотвращению деструктивных изменений в нейронах, усиливает пролиферацию глиоцитов, эндотелиоцитов сосудов с образованием нового кровеносного русла. Это сопровождается в динамике наблюдения более ранним регрессом неврологических расстройств, восстановлением поведенческих реакций у животных.