ПЦР тест-система для обнаружения генома возбудителя листериоза

Систематические исследования контаминированности объектов ветеринарного надзора листериями и изучение биологических свойств циркулирующих штаммов листерий стали насущной проблемой, решение которой может способствовать установлению эпизоотического и эпидемиологического значения этих объектов и проведению целенаправленных мероприятий по недопущению возникновения листериоза среди людей и животных.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделал переворот в диагностике инфекционных болезней, который заключается в повышении эффективности индикации их возбудителей в объектах окружающей среды [1,2,3,6]. Важность ПЦР-диагностики особенно ярко проявляется при оппортунистических инфекциях, к которым ученые относят и листериоз. Разнообразие клинических признаков и степени тяжести протекания заболевания весьма усложняют диагностику последнего, а также бессимптомное носительство клинически здоровыми людьми и животными патогенных видов листерий. Кроме того, листерии могут образовывать Л-формы и переходить в некультивируемое состояние, для обнаружения которых использование традиционных бактериологических методов малоэффективно. Эти трудности можно преодолеть при помощи полимеразной цепной реакции.

Метод флуоресцентной детекции результатов можно проводить в конце реакции (по «конечной» точке) FEP и во время анализа в режиме «реального времени» FRT. Данный метод по сравнению с электрофоретической детекцией обладает рядом преимуществ. Во-первых, сокращается время анализа (учет результатов происходит во время анализа или сразу же после него). Во-вторых, уменьшается риск перекрестной контаминации за счет отсутствия стадии электрофореза. В-третьих, повышается специфичность анализа за счет использования зонда.

Учитывая актуальность вышеизложенной проблемы, нами разработана ПЦР для индикации генома возбудителя листериоза с детекцией в реальном времени.

Материалы и методы исследования . Исследования проводили со штаммами Listeria monocytogenes: А-исходный, АУФ, Янкульский, 9-127, Чистополь, 9-72, 9-128, 9-129. Для контроля специфичности реакции использовали бактерии гетерологичных родов: Brucella abortus шт.19, Salmonella enteritidis и Bacillus cereus №8035.

ДНК из биомассы бактерий и из проб продуктов питания и различных объектов ветеринарного надзора выделяли сорбентным методом.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе ДТ-96 производства ДНК-технология.

Результаты исследований. На основе анализа Gen Banc был проведен дизайн и синтез пары праймеров, комплементарных к регионам гена hly A, отвечающего за продуцирование листериолизина, а также зонда.

В результате исследований были определены оптимальные условия и режимы проведения реакции с данными праймерами.

Программа амплификации: 95°С - 15 мин;

94°С-15с.

42 цикла                                    V

53°С - 30 с. (детекция)

10°С -хранение.

Нами проведены серии опытов для определения пригодности метода ПЦР-РВ при индикации возбудителя листериоза в различных объектах. В качестве объектов исследования использовали различные продукты питания, воду, корма (зерно, фураж) и сточные воды.

Из исследованных методом ПЦР-РВ 685 различных проб, в 32 был выявлен возбудитель листериоза. При бактериологических исследованиях 357 проб грубых, сочных кормов, кормовых добавок и кормов животного происхождения листерии были выявлены в 4 случаях, в ПЦР-РВ было выявлено наличие ДНК листерий еще в 6 пробах. Как показали проведенные исследования, контаминированность листериями кормов составила около 2.5%.

Нами исследовано 410 проб молока и молочных продуктов, из них в двух бактериологически выявлены листерии, дополнительно в пяти пробах выявлены геномы листерий. Контаминированность листериями молока и молочных продуктов в результате наших исследований составила около 1,2%, что свидетельствует о возможности передачи листерий через молочные продукты.

В результате исследований объектов внешней среды (сточных вод, воды из различных источников, почвы, проб растений) бактериологически было выявлено 11 культур листерий, что составило 2,03%. ПЦР тест-система позволила обнаружить еще 10 инфицированных листериями объектов внешней среды. С учетом результатов ПЦР контаминированность объектов внешней среды возбудителем листериоза достигла 3,94%, что свидетельствует о достаточно широкой распространенности последнего во внешней среде. Следовательно, заражение листериями животных в период пастьбы и водопоя вполне возможно,    что необходимо учитывать при проведении противолистериозных мероприятий.

В дальнейшем были получены изоляты и изучены их антигенные свойства. В ходе изучения полученных изолятов установлено, что все они реагировали с поливалентной листериозной агглютинирующей сывороткой Н-АВ и О-II, V,VI,VII, IX; 28 изолятов (87,5%) реагировали с сывороткой I серотипа и только четыре, которые были выделены из продуктов импортного производства (баранина, окорочка кур и индейки, курица) реагировали с сывороткой II серогруппы.

Заключение. В результате проведенных исследований показана инфицированность объектов ветеринарного и санитарного надзора листериями в среднем 2,4%, что свидетельствует о необходимости контроля их безопасности.

Таким образом, результаты наших опытов дают основание предложить ПЦР-РВ для лабораторной диагностики листериоза и индикации этого возбудителя в объектах ветеринарного и санитарноэпидемиологического надзора. Метод привлекателен еще и тем, что патогенный агент можно обнаруживать в режиме реального времени как качественно, так и количественно.

Наши исследования показали, что в Республике Татарстан имеет место контаминация продуктов и объектов вет.надзора возбудителем Listeria monocytogenes, в основном I серотипа. В тоже время, в пищевых продуктах зарубежного производства выявляются листерии второго серотипа.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Белохвостов А.С. ПЦР и лигазные реакции принципы, традиционные методики и нововведения // Молекул. генетика -1993 - №2 - с. 21-26. 2. Гинцбург А.Л., Зигангирова Н.А., Романова Ю.М. // Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии // ЖМЭИ, 1999 - №5 - с. 2224. 3. Елов А.А., Федоров И.А., Суханов Ю.С. // Универсальный однопробирочный метод подготовки проб крови, ее компонентов и других биоматериалов для ПЦР-анализа //Тезисы 3-й Всер. науч. конф. 2000 -Москва - с. 27-28. 4. Третьяков А.Н., Гельфанд В.М., Пантина Р.Л. и др. //Амплификация ДНК за 15-30 минут в одноразовых наконечниках для микродозаторов // Молек. биология - 1994 - Т. 28-63 - с. 74-76. 5. Stinson S.C. //Jdentifiying bacterig: lao bing for a fast track // Chem and Eng. News, -1999, - 77 № 13 - p. 36-38. 6. Wright W.E., Piatsek M.A., Rainey W.E/, Snoy J.W. // Molecular genetic methods in indication and differentiation pathogen microorganisms // Dev. genet. - 1996- № 18 - p. 173-179.

ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНОМА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛИСТЕРИОЗА

Александрова Н.М., Фаизов Т.Х., Усольцев К.В.

Резюме

В результате проведенных исследований при помощи ПЦР-РВ, показана инфицированность объектов ветеринарного и санитарного надзора листериями в среднем 2,4%, что свидетельствует о необходимости контроля их безопасности. Это дает основание предложить метод ПЦР-РВ для лабораторной диагностики листериоза и индикации этого возбудителя в объектах ветеринарного и санитарно-эпидемиологического надзора. Метод привлекателен еще и тем, что патогенный агент можно обнаруживать в режиме реального времени как качественно, так и количественно.

PCR TEST SYSTEM FOR DETECTION OF PATHOGEN GENOME LISTERIOSIS

Aleksandrova N.M., Faizov T.H., Usoltsev K.V. Summary

Studies using PCR-RV shows escalating rates of veterinary and sanitary control at an average 2.4% listeriâmi, which suggests a need to monitor their safety. This gives grounds to suggest a method of PCR-PB for laboratory diagnosis of listeriosis and indication of this pathogen in veterinary and sanitary-and-epidemiologic supervision. The method is the fact that the pathogenic agent can be detected in real time both qualitatively and quantitatively.