Переработка отходов зерновой промышленности при помощи гидролаз S. cerevisae

Ученые, занимающиеся переработкой зерна и вопросами рационального питания, говорят о высокой биологической и пищевой ценности всех частей зерна и о недостаточном внимании людей к своему здоровью в тех случаях, когда исключаются из рациона питания так называемые побочные продукты мукомольных производств, содержащие ряд ценных компонентов [1-3], поэтому возникает необходимость пересмотреть действующую концепцию зернопереработки для более полного, комплексного использования всей сырьевой базы. Биотехнологическая переработка сырья предусматривает использование комплексных ферментных препаратов, содержащих гидролазы, способные превращать в олигомеры углеводы, белковые вещества и другие компоненты. Активный гидролитический комплекс присутствует в дрожжах

S. cerevisae. Более того, клеточные стенки дрожжей имеют в своем составе маннанолигосахариды, которые в желудочно-кишечном тракте эффективно связывают и абсорбируют различные патогенные микроорганизмы, включая E. coli, Clostridium, Vibrio, Salmonella и др., таким образом, снижается возможность возникновения инфекции, они являются эффективными сорбентами микотоксинов [4,5]. Дрожжевая биомасса – полноценный источник белковых веществ, витаминов, полисахаридов и микроэлементов, что позволяет рассматривать микроорганизмы как перспективные субстраты для получения биологически активных добавок, но питательная ценность дрожжевой биомассы ограничена низкой доступностью внутриклеточных биополимеров для действия пищеварительных ферментов и высоким содержанием нуклеиновых кислот. Для полноценного усвоения, как белковых веществ, так и комплекса полисахаридов, необходимо разрушить клеточные стенки дрожжей и перевести высокомолекулярные полимеры, содержащиеся в них, в растворимые легкоусвояемые соединения [4, 6, 7]. При этом возможно получение биологически активных веществ [8], однако необходимо не забывать и о необходимости денуклеинизации образцов. Деструкция дрожжевой клетки может быть осуществлена с помощью ферментативного катализа [9], при этом возможно получить ряд биологически активных добавок (БАД) комплексного действия.

Известен ряд способов переработки растительного сырья [10-13], в т.ч. и зерновых отходов, на кормовые белковые добавки. Термообработка и ферментативный гидролиз зерновых культур проводится при t = 65…90 °C с последующим выращиванием дрожжей. Но в большинстве публикаций отсутствует количественная оценка эффективности процессов, которая затрудняет выбор оптимальных вариантов. Авторами [10, 13] была исследована эффективность процесса ферментативного гидролиза зернового сырья различными ферментными препаратами: амилосубтилином, глюкаваморином, целловиридином. Установлено, что перед ферментативным гидролизом зерновое сырье необходимо подвергнуть предварительной термообработке: соотношение твердой и жидкой фазы 1:5, гидролиз при температуре 80 - 100 °С на протяжении 1 часа. Оптимальные условия последующего ферментативного гидролиза зернового сырья с ферментными препаратами амилосубтилином, глюкаваморином, целловиридином (температура 58…60 С, рН 5,0…6,0; время обработки 1,5 часа) обеспечивают высокую степень конверсии полисахаридов отрубей - 84 % и степень осахаривания 34…38 % [13].

Целью исследований является усовершенствование биотехнологии комплексной переработки отходов зерновой промышленности с помощью комплекса гидролаз дрожжей S. cerevisae .

Объекты и методы исследования

Культивирование дрожжей S. cerevisae осуществляли на питательной среде, содержащей мелассу как источник сахаров, минеральные соли, при наличии источника селена – раствора селенистой кислоты или селенита натрия либо другой соли селена. Как источник сахаров дополнительно использовали гидролизат растительного сырья. Культивирование проводили при наличии твердого носителя – остатка после гидролиза углеводсо- держащего сырья. Для получения гидролизатов были использованы отходы мукомольного и крупяного производства (отруби, пленки, мучка), которые обрабатывали сульфатной, хлороводородной, фосфорной, этановой кислотами с массовой долей кислоты 0,5…5 %. Содержание сахаров в гидролизате контролировали и замещали от 5 до 80 % мелассы на гидролизат.

Для роста дрожжей использовали соли в таком соотношении компонентов, масс. %:

(NH 4 ) 2 SO4   0,46…0,55;

КН 2 РО4    0,08…0,09;

К 2 НРО4    0,011…0,19;

MgSO4     0,045…0,055;

NaCl       0,001…0,015;

СаСl 2        0,006…0,0154

селеновая кислота или селенит натрия либо другие соли селена 0,00002…0,00015;

твердый углеводсодержащий остаток 8,0…15,0;

гидролизат углеводсодержащего растительного субстрата до 100%.

Дрожжевую биомассу подвергали тепловой обработке (термолизу) для облегчения проведения ферментолиза, поскольку термолизованные клетки [9] дрожжевой суспензии поддаются ферментолизу намного легче. Плазмолиз клеток осуществляли в присутствии хлористого натрия (на протяжении 2 ч при 500 С) для проведения автолиза либо гетеролиза.

Общий химический и биополимерный состав сырья, полученных БАД, содержание влаги, эфирорастворимых веществ, свободных сахаров, золы определяли общепринятыми методами [14]. Азотистые вещества фракционировали методом последовательной экстракции навески водой, солевым буферным раствором и раствором гидроксида натрия. Общий азот, а также азот белков отдельных фракций и белкового концентрата определяли методом Кьельдаля. Белковый азот – после осаждения его основной солью сернокислой меди по Барнштейну. Количество небелкового азота рассчитывали по разности между содержанием общего и белкового азота [14]. Чистоту изучаемых полисахаридов и олигосахаридов проверяли по постоянству соотношения моносахаров в гидролизате после переосажде-ния. Гомогенность доказывали гель-фильтрацией на сефадексах G-100, G-150, G-200 и ДЭАЭ-целлюлозе [15].

Для определения биологической активности (БА) [16] препаратов использовали расчет по формуле: БА _ ( А 0D - A D0 ) • V • K ,

(AK — AK0 )• m где: БА – биологическая активность, усл. ед;

D

A ₀ – исходная оптическая плотность опытного образца;

D

A ₁₂₀ – оптическая плотность опытного образца через 120 с;

K

A ₀ – исходная оптическая плотность контрольного образца;

K

A ₁₂₀ – оптическая плотность контрольного образца через 120 с;

V – объем исследуемых проб, 10 см³;

K – коэффициент разведения пробы (1:10) m – масса (объем) исследуемого образца. Результаты и их обсуждение

При выращивании дрожжей на гидролизате в присутствии твердой фазы достигается активация роста дрожжевой биомассы, становится возможным получение БАД с высоким содержанием белка, углеводов, минеральных веществ, в частности селена, биологически активных веществ. Важным является то, что дрожжи начинают интенсивно производить гидролазы, которые необходимы для снабжения углеводами в процессе жизнедеятельности микроорганизмов. Активация выработки гидролаз объясняется необходимостью переработки микроорганизмами твердого остатка, имеющегося в культуральной среде. Твердый остаток, отделенный после культивирования, промывали раствором хлорида натрия для уменьшения количества нуклеиновых кислот в целевом продукте, который после сушки можно использовать в качестве БАД, в том числе, при приготовлении теста. При этом свежеприготовленный препарат содержит живые клетки дрожжей, поэтому в хлебобулочных изделиях количество вносимых дрожжей уменьшают наполовину. В том случае, если препарат предназначен для хранения, его высушивают для повышения стабильности и обеззараживания при температуре 120-140 °С, при этом дрожжевые клетки гибнут, после центрифугирования либо фильтрации и отделения твердой массы получают высокобелковые добавки, пример состава которых приведен в табл. 1.

В надосадочной жидкости остается значительное число ферментов, аминокислот, сахаров (олигосахаридов) и других полезных компонентов, которые также возможно использовать как БАД. В святи с этим были проведены дополнительные исследования, связанные с разрушением клеточных стенок дрожжей для получения БАД, которые включают не только белковую, углеводную, микроэлементную, витаминную составляющие, но и олигомеры углеводов, пептиды, аминокислоты и другие биологически активные вещества (БАВ).

Динамика гидролиза дрожжевой биомассы в процессе автолиза и ферментативного гидролиза представлена на рис. 1. Как видно из приведенных данных, сначала накопление редуцирующих веществ идет медленно, потом количество их быстро растет. То же можно сказать о накоплении азотистых веществ. При увеличении длительности процесса ферментативного гидролиза высокомолекулярных полимеров клетки происходит накопление аминного азота и фракционный состав гидролизатов дрожжевой биомассы становится сложнее. Быстрее и в большей степени протекает гидролиз после предыдущего термолиза биомассы дрожжей, наименьшая деструкция полимеров происходит при автолизе.

Таблица 1 – Состав БАД с селеном и дрожжами

Вид углеводсодержащего растительного субстрата	Белковые вещества	Нерастворимые углеводы	Количество нуклеиновых кислот	Содержание селена в БАД, полученных при культивировании, мг/г n∙10–3
				в обычных условиях	в присутствии источника селена
1. Пшеничные отруби	21,4 ± 0,3	66,5 ± 0,5	1,2 ± 0,4	3,0 ± 0,1	5,3 ± 0,1
2. Овсяные отруби	23,6 ± 0,3	62,1 ± 0,4	1,6 ± 0,4	3,8 ± 0,1	6,2 ± 0,1
3. Отруби тритикале	21,9 ± 0,3	64,3 ± 0,4	1,1 ± 0,5	3,3 ± 0,1	5,4 ± 0,1
4. Оболочки сои	19,9 ± 0,3	63,7 ± 0,5	1,3 ± 0,5	4,2 ± 0,2	7,2 ± 0,1
5. Мучка сои	21,8 ± 0,3	62,1 ± 0,5	1,6 ± 0,3	4,5 ± 0,1	7,9 ± 0,1
6. Оболочки гороха	18,5 ± 0,3	61,6 ± 0,4	1,3 ± 0,4	3,9 ± 0,2	6,6 ± 0,1
7. Мучка гороха	19,5 ± 0,3	64,8 ± 0,6	1,6 ± 0,4	4,1 ± 0,1	6,5 ± 0,1

Рис. 1 – Динамика гидролиза дрожжевой биомассы в процессе автолиза и ферментативного гидролиза: 1 – автолиз; 2 – плазмолиз с ферментативным гидролизом; 3 – термолиз с ферментативным гидролизом

Необходимо отметить, что уже через 4 часа гидролиза высокомолекулярные биополимеры дрожжевой биомассы переходят в растворимое состояние и представляют собой препарат, который отличается высоким содержанием аминокислот, пептидов, ферментов и может быть использован в качестве биологически активной добавки (рис. 2).

амилосубтилин целловеридин ферментный

ферментний ферментний комплекс дрожжей комплекс дрохжей с оразцом комплекс дрожжей с образцом

и Сухие вещества

тритикале

СП Редуцирующие вещества

гороха

и аминный азот

Рис. 2 – Влияние действия ферментных препаратов на накопление сухих веществ, аминного азота, редуцирующих веществ в образцах с добавлением твердого остатка отрубей тритикале и твердого остатка мучки гороха

Увеличение длительности ферментативного гидролиза до 36 часов позволяет увеличить часть пептидов с молекулярной массой 1500-5000, а часть низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот с молекулярной массой менее 1500 увеличи- вается в 2 раза (до 61 %) за счет гидролиза высокомолекулярных пептидов (рис. 3). Это дает возможность получить препарат с высоким содержанием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов. Таким образом, для обеспечения необходимой степени и глуби- ны гидролиза биополимеров дрожжевых клеток достаточно варьировать длительностью процесса и дозированием ферментов. В итоге была разработана схема ферментолиза микробной биомассы с получением препаратов разного функционального назначения.

Рис. 3 - Фракционный состав ферментолизатов дрожжевой биомассы после 18 ч (а) и 36 ч (б) гидролиза. Молекулярная масса (Да) : 1 - больше 10000; 2 - от 5000 до 10000; 3 - от 1500 до 5000; 4 - менее 1500

В процессе гидролиза параллельно наблюдается прохождение двух процессов: гидролиз β-глюкана клеточной стенки с образованием олигомерных форм глюкоолигосахаридов и их гидролиз с накоплением мономера глюкозы. Этот процесс достаточно эффективно идет на протяжении 5-6 часов в случае экстрактов - количество олигомерных форм глюкозы уменьшается за это время с 5,66,1% до 1,4-1,8%. Скорость процесса уменьшается при иммобилизации комплекса на твердом остатке - пищевых волокнах (ПВ) приблизительно на 21-25 %, но при увеличении времени деструкции до 24 часов количество олигомеров в растворе уменьшается до незначительных количеств - 0,6-0,8 %.

Таким образом, в результате автолиза возможно получение активированного препа- рата, содержащего частично гидролизованные клеточные стенки, в составе которых преобладают β-глюканы, манноолигосахариды, присутствуют аминокислоты, низкомолекулярные пептиды, витамины.

На следующем этапе исследования определяли антиоксидантные свойства препарата для подтверждения возможности использовать его как БАД. Полученные в результате расчетов данные приведены в табл.2. Самыми эффективными антиоксидантами оказались препараты из мучки бобовых, немного меньше активность у препаратов из оболочек бобовых, далее – овсяные отруби, а у пшеничных отрубей и отрубей тритикале значения антиоксидантных свойств были близкими.

Таблица 2 – Биологическая активность образцов препаратов

Вид углеводсодержащего носителя	Биологическая активность, усл.ед
1. Пшеничные отруби	950
2. Овсяные отруби	1000
3. Отруби тритикале	940
4. Оболочки сои	1050
5. Мучка сои	1120
6. Оболочки гороха	1100
7. Мучка гороха	1150

Необходимо отметить, что сушка, хранение препарата, содержащего гидролитический комплекс ферментов, продукты деструкции дрожжей и растительного сырья – отходов зерноперерабатывающей промышлен- ности, требуют особых условий, потому осуществлено получение препарата путем иммобилизации на ПВ, поскольку в этом случае стабильность комплексов выше.

Во время высушивания под действием температуры и влаги происходит частичный гидролиз компонентов препарата и ПВ с образованием моно-, ди-, олигосахаридов, которые повышают биологическую ценность добавки и в определенной степени уменьшается ферментативная активность иммобилизованных на ПВ комплексов (на 28…35%). Необходимо отметить, что благодаря иммобилизации на ПВ препарат получает стойкость и стабильность при хранении, поскольку гидролитическая активность комплекса практически не изменяется в течение 3 месяцев хранения. Результаты предварительных исследований позволяют считать целесообразным проведение определенного ряда операций, направленных на получение БАД с полиферментной активностью.

Позитивное влияние, которое оказывают пищевые добавки на здоровье человека, их способность улучшить качество продуктов и напитков, ставит задачу дальнейшего изучения и совершенствования технологии получения новых препаратов до состояния технологической инновации, что представляется как экономически, так и социально целесообразным. Использование препаратов, имеющих антиоксидантные свойства в составе продуктов или как самостоятельные БАД позволит повысить потребительскую ценность продуктов благодаря гармонизации и усвояемости пищевых ингредиентов, что важно для всех видов продуктов и напитков, а также расширит ассортимент новых лечебнопрофилактических продуктов на основе отходов зерновых производств.

Заключение

Позитивное влияние, которое оказывают пищевые добавки на здоровье человека, их способность улучшить качество продуктов и напитков, предопределяет задачи для дальнейшего изучения и совершенствования технологии получения новых препаратов и доведения технологии до состояния технологической инновации, что представляется как экономически, так и социально целесообразным. Использование препаратов, имеющих антиоксидантные свойства, в составе продуктов питания или в виде самостоятельных БАД позволит повысить потребительскую ценность рационов питания населения благодаря гармонизации и повышению усвояемости пищевых ингредиентов, что важно для всех видов продуктов и напитков, а также способствует расширению ассорти-мента новых лечебно-профилактических продуктов на основе отходов зерновых производств.