Перспективы метода выделения рибонуклеиновой кислоты из клеток линии HaСаТ при воздействии разных факторов для задач регенеративной биомедицины

В настоящее время исследования, проводимые на клеточных культурах, занимают важное место в биомедицинских и экспериментальных работах. Исполь- зование клеток in vitro позволяет оценивать влияние различных веществ на жизнеспособность, пролиферацию и морфофункциональное состояние клеток в контролируемых условиях. Такой подход является удобным инструментом для предварительной оценки биологической активности соединений перед их дальнейшим исследованием в экспериментах in vivo.

Клеточная линия HaCaT представляет собой стабильную и хорошо изученную модель перевиваемых кератиноцитов человека. Эти клетки широко используются для исследования влияния биологически активных веществ на клеточную жизнеспособность, поскольку они устойчивы к культивированию и чувствительны к изменению состава культуральной среды. Изменение количества жизнеспособных клеток и их морфологии позволяет оценить как цитотоксические, так и пролиферативные эффекты исследуемых факторов [4; 6].

β-аланин ― одна из распространенных небелковых аминокислот, участвующая в метаболических путях, включая синтез дипептида карнозина. Аминокислота может действовать как нейромедиатор или нейромодулятор, влияет на уровень таурина и выступает в качестве конкурентного антагониста гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) [1; 2].

Актуальность исследования обусловлена потребностью регенеративной биомедицины и клеточных технологий в поиске новых условий и компонентов культивирования in vitro, для получения функционально полноценных клеточных материалов. Одним из компонентов, вызывающим интерес, является β-аланин, однако эффекты его прямого воздействия на клетки, например линии HaCaT, мало изучены [5]. Помимо оценки жизнеспособности клеток важным этапом исследования является оценка влияния аминокислоты на выделение тотальной РНК из клеток, так как ее количество и качество отражают функциональное состояние клеток, что является важным этапом на пути определения транскрипционной активности генов, кодирующих белки, которые могут существенно влиять на скорость ранозаживления. Поэтому важно получение РНК, пригодной для последующего молекулярно-биологического анализа [7; 9].

Цель исследования — изучить влияние различных концентраций β-аланина на жизнеспособность клеток HaCaT in vitro и на получение рибонуклеиновой кислоты.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• 1.    Определить пролиферативный потенциал клеток линии HaCaT в присутствии разных концентраций в среде культивирования β-аланина in vitro .

• 2.    Выявить цитотоксичную концентрацию β-аланина для клеток линии HaCaT.

• 3.    Оценить выход рибонуклеиновой кислоты.

Материалы и методы исследования

Работа с клеточными культурами проводилась в условиях асептики. Клеточная линия HaCaT была приобретена в институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН. Клетки культивировали при 37 °C в атмосфере 5% CO2, в СО2-инкубаторе Binder C 150 E2 (Германия). Работа с культурами осуществлялась в ламинарном боксе биологической безопасности БМБ-II-«Ламинар-С»-1,5 (Lamsystems, Россия). Для культивирования использовали среду DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 1%-ного раствора пенициллина/стрептомицина и гентамицина в объеме 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно (ПанЭко, Россия), 10%-ной фетальной бычьей сыворотки (GlobаlKang, Китай). Контроль включал полную сре- ду и среду без сыворотки с добавлением 1%-ного раствора пенициллина/стрептомицина и гентамицина.

β-аланин вносили в концентрациях 2,5, 6,2, 12,5 и 25 мг/мл в среду для культивирования. Посев клеток (пассаж 44) осуществляли в культуральных флаконах площадью 25 см2 с плотностью 1*105 клеток/флакон. Культивировали в течение 7 суток с заменой среды каждые 48 часов.

Оценку состояния клеток и фотодокументирование результатов осуществляли методом микроскопии с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного цифровой камерой-видеоокуляром ToupCam 5.1 MP (сенсор Aptina MT9P001, разрешение 2 592×1 944 пикселей, производитель ToupTek Photonics). Проводили ежедневное наблюдение адгезированных клеток с сохранной морфологией в стандартном поле зрения (увеличение ×200) с использованием окулярной сетки. Подсчет клеток вели с помощью счетчика клеток (RWD, Китай).

Выделение тотальной РНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции с использованием реагента ExtractRNA (BioLabmix, Россия), согласно протоколу производителя. Количество полученной РНК измеряли на микроспектрофотометре (ALLSHENG, Китай).

Воздействие аланина

β-аланин вносили в культуральную среду ДМЕМ в концентрациях 2,5, 6,2, 12,5 и 25 мг/мл во флаконы площадью 25 см2. Кроме экспериментальных групп с разной концентрацией аланина были контрольные группы, положительный контроль среда ДМЕМ с 10%-ной сывороткой и контроль отрицательный ― среда без сыворотки. Оценку влияния разных концентраций аланина проводили по изменению количества клеток по сравнению с контрольными образцами.

По окончании воздействия исследуемых веществ клетки снимали с поверхности культурального пластика с использованием раствора трипсина. Получали однородную клеточную суспензию и проводили подсчет жизнеспособных клеток с помощью счетчика клеток. Количество клеток в суспензии в опытных группах при концентрации аминокислоты 2,5, 6,2, 12,5 мг/мл составило 2,8 х 106, 3,3 х 106 и 3,0х 106 клеток соответственно, что на 8, 26 и 15% выше данных контрольной группы. Кератиноциты линии HaCaT при микроскопировании после 7 дней культивирования имеют нормальное морфологическое состояние и сохраняют способность к адгезии и пролиферации в присутствии в среде культивирования β-аланина в указанных выше концентрациях. В группе с концентрацией аланина 25 мг/мл в питательной среде количество клеток составило 1,6 х 106, что ниже контрольных данных на 37%. При микроскопировании данной группы было отмечено много открепленных клеток.

Результаты

Кератиноциты линии HaCaT, относящиеся к эпидермальному слою кожи, обладают следующими морфологическими особенностями: округлые и полигональные мелкие до 25 мкм клетки с центрально расположенным ядром и 2–3 ядрышками, с преобладанием в цитоплазме зернистости, без отростков. Физиологические особенности кератиноцитов in vitro следующие: сильная адгезия (прикрепление) к культуральному пластику (поверхности), образование на поверхности монослоя, активное взаимодействие с окружающими клетками, заключающееся в тесном контакте, что демонстрировалось в поле зрения.

При анализе в положительном контроле (культуральная среда с сывороткой без добавления исследуемых концентраций аминокислоты) клетки сохраняли типичную эпителиальную морфологию, высокую степень адгезии и пролиферативную активность. Клеточный монослой был равномерным, без признаков деструкции, что соответствовало нормальному уровню жизнеспособности (рис. 1а).

В негативном контроле (культивирование в среде без сыворотки) отмечалось снижение плотности клеточного монослоя, замедление пролиферации и появление слабоадгезивных клеток, что свидетельствовало о снижении метаболической активности и жизнеспособности (рис. 1б).

В культуре клетки эпидермиса кератиноциты адгезивны к поверхности, способны активно делиться в среде ДМЕМ с 10% фетальной бычьей сывороткой, и с добавлением аминокислоты в концентрациях 2,5, 6,2, 12,5 мг/мл образовывать монослой, т. е. функционировать как полноценные клеточные системы (рис. 2).

а) при положительном контроле. Увеличение х 200

б) при негативном контроле. Увеличение x 200

Рис. 1. Клетки линии НаСаТ (Р44) в среде с фетальной сывороткой и без добавления сыворотки

• а)    особенности HaCaT при добавлении 2,5 мг/мл β-аланина in vitro .

Увеличение x 200

• б)    особенности HaCaT при добавлении β-аланина 6,2 мг/мл in vitro .

Увеличение x 200

Рис. 2. Клетки линии НаСаТ (Р44) при введении в среду β-аланина 2,5 и 6,2 мг/мл

а) морфоструктурные особенности          б) морфоструктурные особенности

HaCaT12,5 мг/мл in vitro . Увеличение x 200 HaCaT 25 мг/мл in vitro . Увеличение x 200

Рис. 3. Клетки линии НаСаТ (Р44) при введении в среду β-аланина 12,5 и 25 мг/мл

В целом в экспериментальных группах аланин продемонстрировал умеренный пролиферативный эффект, наиболее выраженный в концентрациях β- аланина 6,2, 12,5 мг/мл. При сравнительном анализе контрольных и экспериментальных групп выявлены статистически и биологически значимые различия в жизнеспособности и морфофункциональном состоянии клеток линии HaCaT при концентрации 25 мг/мл. При концентрации 25 мг/мл аминокислоты жизнеспособность клеток была снижена по сравнению с группами 2,5, 6,2, 12,5 мг/мл, что проявлялось в виде цитотоксичности (рис. 3б).

Выделение рибонуклеиновой кислоты методом фенол-хлороформной экстракции с использованием реактива «Лира» компании ООО «BIOLABMIX» (Россия) производили в несколько этапов, включавших удаление из раствора углеводов, липидов, белков. По окончании с помощью спектрофотометра Nano-500 провели измерение концентрации выделенной РНК (рис. 4). В завершение эта выделенная РНК послужит для дальнейшего молекулярного биологического исследования экспрессии генов белков, кератиноцитов и ламинина.

Рис. 4. Концентрация выделенной РНК из клеток линии НаСаТ при воздействии различных концентраций β-аланина

На рисунке 4 отражены значения концентрации РНК в исследуемых группах. К+ ― позитивный контроль, последующие группы 1, 2, 3 ― с добавлением β-аланина в концентрациях 2,5, 6,2 и 12,5 мг/мл соответственно. Установлено, что во всех экспериментальных группах наблюдается значительное увеличение концентрации РНК по сравнению с контролем (25,742 нг/мл). Максимальные значения достигнуты при концентрациях β-аланина 6,2–12,5 мг/мл, концентрация РНК составила 411–424 нг/мл.

Выводы

• 1.    Клеточная линия кератиноцитов человека HaCaT является воспроизводимой и информативной моделью in vitro для оценки цитотоксичности и цитопро-тективного потенциала биологически активных веществ, применяемых в дерматологии и регенеративной медицине.

• 2.    β-Аланин в диапазоне концентраций 2,5–12,5 мг/мл оказывает умеренно выраженное цитопротективное действие на клетки HaCaT, способствуя сохранению их морфофункционального состояния и жизнеспособности по сравнению с данными контрольных групп. Было установлено, что концентрация β-аланина 25 мг/мл в среде культивирования клеток НаСаТ является цитотоксичной.

• 3.    Концентрация аминокислоты в среде культивирования влияет на пролиферацию клеток линии НаСаТ и на выход РНК.