Перспективы разработки интраназальной вакцины против респираторных болезней новорожденных телят

Н.И. Перспективы разработки интраназальной вакцины против респираторных болезней новорожденных телят // Ученые записки Казанской академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2025. Том 263 (3). С. 87-93.

Введение. В структуре заболеваний крупного рогатого скота заболевания молодняка вирусной этиологии занимают одно из ведущих мест. В современных условиях ведения скотоводства – это одна из причин потерь новорожденных телят и телят более старшего возраста. При традиционной технологии ведения скотоводства на долю этих болезней приходится более 40 % всех случаев заболеваний молодняка [1, 2].

Массовые респираторные заболевания новорожденных телят с симптомами конъюнктивита, поражения верхних и нижних дыхательных путей представляют наиболее серьезную проблему для скотоводства многих сельхозпредприятий Российской Федерации [1, 3, 4].

Респираторные заболевания крупного рогатого скота – это комплекс заболеваний, вызываемых многочисленными вирусными и бактериальными патогенами [5, 6]. Основные вирусные патогены комплекса включают: вирус герпеса крупного рогатого скота типа 1, также известный как вирус инфекционного ринотра-хеита крупного рогатого скота (ИРТ), вирус парагриппа крупного рогатого скота-3 (ПГ-3) и респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ) [7, 8].

Вирус ПГ-3 является наиболее часто встречающимся этиологическим агентом, эндемичным для популяций крупного рогатого скота во всем мире. ПГ-3 обычно протекает в легкой или умеренной форме респираторного заболевания, но при инфицировании другими вирусными агентами и развитии вторичной бактериальной инфекции резко возрастает риск тяжелого поражения дыхательной системы с неблагоприятным прогнозом. Считается, что ПГ-3 играет важную роль в комплексе респираторных заболеваний [5].

РСВ КРС может вызывать тяжелое заболевание у животных всех возрастов, но в первую очередь поражает молодых телят во время повторяющихся сезонных вспышек. Клинически заболевание характеризуется лихорадкой, кашлем и тахипноэ, часто быстро прогрессирующими до одышки. РСВ считается одним из предрасполагающих факторов, приводящих к вторичному заражению и эпизоотиям пастереллеза крупного рогатого скота [9, 10].

Вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота также является угрозой для благополучия сельхозпредприятий из-за его серьезного воздействия на продуктивность и здоровье животных. ИРТ часто протекает субклинически. После выздоровления животные становятся пожизненными латентными носителями вируса [11, 12].

Респираторные заболевания вызывают прямые потери производства за счет снижения надоев, потери веса, абортов, бесплодия, более высокой восприимчивости животных к вторичным бактериальным инфекциям и смертности [9].

Вспышки респираторных заболеваний часто затрагивают телят в возрасте всего нескольких недель. Поэтому важно, чтобы вакцинация быстро индуцировала защиту от заболевания. Большинство телят в возрасте до 3 месяцев имеют циркулирующие материнские антитела, приобретенные через молозиво. Эти антитела не обеспечивают должной защиты от заболеваний, но могут влиять на эффективность системной вакцинации. При этом именно интраназальная вакцинация является методом, с помощью которого может быть быстро вызван иммунитет (обходя возможное влияние материнских антител) [13].

Телята рождаются агаммаглобулинемич-ными и должны потреблять материнское мо лозиво для поддержки иммунитета [14]. Хотя материнская передача антител новорожденному теленку обеспечивает множество больших преимуществ, высокие уровни материнских антител связаны с задержкой выработки антител новорожденным, а также с селективным ингибированием реакций лимфоцитов. Потенциал материнской блокады вызвал обеспокоенность относительно практики ранней вакцинации для предотвращения респираторных заболеваний крупного рогатого скота, поскольку материнские антитела могут присутствовать до 6 месяцев. Вакцинация для сниже ния заболеваемости была бы полезной, по скольку респираторные инфекции являются основной причиной заболеваемости и смерт ности у молочных телят до перевода их в профилакторий [15].

Установлено, что телята в возрасте от 3 до 8 дней способны формировать иммунный ответ слизистой оболочки, даже при наличии материнских антител. Результаты испытания назальных вакцин против вирусных и бактериальных инфекций свидетельствуют, что они могут создавать не менее эффективную защиту, чем при введении той же вакцины с помощью инъекции. Кроме того, интраназальная вакцина позволяет вырабатывать не только гуморальный, но и индуцировать секреторный, местный иммунитет [16].

Респираторные заболевания крупного рогатого скота являются основной причиной смертности телят. В связи с этим важность ранней защиты новорожденных телят не вызывает сомнений [17, 18, 19].

Таким образом, целью работы являлось определение перспективы разработки интра-назальной вакцины против респираторных болезней новорожденных телят, а также подбор кандидатных штаммов вирусов для её создания.

Условия, материалы и методы. На первом этапе исследования научная литература, касающаяся тематики работы, была проанализирована формально-логическими методами.

На втором этапе проведен подбор штаммов вирусов для создания вакцины, а также оценены их инфекционный, гемагглютинирующий и гемадсорбирующие титры.

В качестве кандидатных рассмотрены штаммы вирусов ИРТ («ТК-А (ВиЭВ)-В2»), ПГ-3 («ПТК-45/86»), РСВ («Lym-56» и «VR-1339»). Для репликации вирусов использовалась перевиваемая линия культуры клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК).

Заражение штаммами в дозе 0,1 lg ТЦД 50 / см³ проводили на 80–90% конфлюентном монослое клеток возрастом 24–48 часов. Перед инокуляцией промывали клетки фосфатносолевым буфером (pH 7,4±0,1). С целью адсорбции вируса флаконы инкубировали при температуре 37±0,5 ºС в течение одного часа, встряхивая каждые 20–30 минут для перераспределения инокулята. Адсорбцию завершали добавлением среды Игла МЕМ. Инфицированные культуры клеток инкубировали при температуре 37±0,5 ºС, ежедневно просматривая под микроскопом на наличие характерных морфологических (цитопатических) изменений клеток [20].

Оценка качества репликации вирусов ИРТ, ПГ-3 и РС на клеточных линиях проводилась путем определения инфекционных титров согласно общепринятой методике L. Reed и H. Muench [21] по прямому цитопатическому действию вируса на клетки и выражалась в lg ТЦД50/см3 (50%-ная тканевая цитопатическая доза).

Уровень гемагглютининов вируса ПГ-3 определялся в РГА с использованием 1%-ной взвеси эритроцитов морской свинки. Кровь брали из краевой вены уха морской свинки.

Для постановки РГА использовали планшеты полимерные для иммунологических реакций (Медполимер, Санкт-Петербург). Реакцию проводили в трех повторностях. Для этого во все лунки вносили по 50 мкл изотонического раствора. В лунки А1-А3 и А4-А6 вносили по 50 мкл вируссодержащего материала ПГ-3 и проводили последовательное двукратное разведение антигена (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256). Далее во все лунки вносили 50 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. В контроле к 50 мкл изотонического раствора добавляли 50 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. Результаты титрования учитывали через 60-90 мин при полном оседании эритроцитов в контрольных лунках.

Гемадсорбирующие свойства вируса ПГ-3 определяли на культуре клеток при титрации с использованием 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки. В интактной культуре эритроциты полностью удалялись изотоническим раствором, а некоторые из оставшихся плыли вместе с жидкостью, при положительной реакции на поверхности зараженных клеток отмечали диффузную адсорбцию эритроцитов.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью пакета MS

Excel с использованием методов описательной статистики. Вычисляли арифметическую среднюю (М) и ошибку среднего значения (m).

Результаты и обсуждение. Разработка живой аттенуированной вакцины для назальной иммунизации имеет потенциальные преимущества по сравнению с традиционной парентеральной вакцинацией. Во-первых, учитывая изменчивость пассивного переноса материнского иммуноглобулина, трудно предсказать, когда парентеральная вакцинация молодых телят обеспечит иммунную защиту от этих вирусов. Назальная иммунизация может с большей вероятностью иммунологически подготовить молодых телят к воздействию материнских антител. В этом случае, когда материнские антитела распадаются до непро-тективных концентраций, интраназально вакцинированные телята будут иметь активный иммунитет и избегать «окна восприимчивости» к вирусной инфекции [22, 23]. Второе преимущество заключается в том, что вакцинация слизистой оболочки с большей вероятностью предотвращает вирусную инфекцию, а не просто снижает заболеваемость, преимущественно стимулируя местные (IgA) реакции [24]. Это особенно актуально для ПГ-3, ИРТ и РС, поскольку эти вирусы заражают и размножаются в эпителиальных клетках слизистой оболочки. Интраназальные вакцины являются дополнительным инструментом для усиления защиты от респираторных инфекций путем стимуляции иммунного ответа слизистой оболочки. Эти вакцины больше похожи на естественную инфекцию, которая возникает, когда патоген проникает через слизистую оболочку носа [25, 26].

Многочисленные исследования продемонстрировали эффективность интраназальной вакцинации в условиях материнских антител после заражения вирусами респираторных инфекций [27, 28, 29].

Через сутки после заражения штаммом «ТК-А(ВИЭВ)-В2» на монослое перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК наблюдалось проявление цитопатического действия (ЦПД) вируса ИРТ КРС в виде симпластообразова-ния, округления клеток, которые собирались «гроздьями» вокруг пустот в монослое. Инфекционный титр в третьем пассаже составил 6,17±0,09 lg ТЦД 50 /СМ³.

Первые признаки характерного ЦПД, типичного для ПГ-3, отмечали через 48 ч после заражения монослоя культуры клеток ЛЭК. В отличие от вируса ИРТ ЦПД у вируса ПГ-3 развивалось медленнее. Набухание, округление и образование отдельных скоплений клеток происходило через 48 ч после заражения при сохранении целостности монослоя. Ярко выраженное ЦПД проявлялось только на 7 сутки. Через 7 суток с момента заражения культуры клеток ЛЭК цитопатическое действие штамма характеризовалось деструкцией монослоя, отторжением клеток и образованием пустот.

Титр инфекционной активности штамма «ПТК-45/86» вируса ПГ-3 скота в третьем пассаже составил 5,67±0,10 lg ТЦД 50 /см³. После проявления ЦПД на культуре клеток ЛЭК ставили РГАд. Титр вируса по способности к гемадсорбции соответствовал 5,33±0,10 lg. Также после третьего пассажа вируса на 7 сутки ставили РГА. Титр штамма «ПТК-45/86» в РГА составил 53,33±13,06 (приведена обратная величина среднеарифметического значения титров).

Культивирование штаммов РСВ на перевиваемой линии культур клеток ЛЭК могло сопровождаться как ярко выраженной деструкцией монослоя, отторжением клеток и образованием пустот, так и формированием скоплений клеток (в виде так называемых фокусов), т.е. развитием цитопатологии синцитиального типа.

Проведено три последовательных пассажа аттенуированных штаммов РСВ КРС «VR-1339» и «Lym-56» на культуре клеток ЛЭК с максимальным проявлением ЦПД на 7 сутки после заражения и инфекционным титром в третьем пассаже - 4,42±0,18 lg ТЦД50/см3 и 4,50±0,18 lg ТЦД50/см3 соответственно.

Выводы. Респираторные заболевания крупного рогатого скота представляют собой комплексную полиэтиологическую проблему, характеризующуюся существенным негативным воздействием на животноводческие комплексы страны. Установлено, что данные заболевания являются доминирующим фактором заболеваемости и смертности среди телят, что обусловливает критическую необходимость разработки эффективных профилактических стратегий с первых дней жизни молодняка. Научными исследованиями подтверждено, что в этиологии респираторных инфекций участвуют различные микроорганизмы, при этом ключевую патогенетическую роль играют вирусы парагриппа-3, инфекционного ри-нотрахеита и респираторно-синтициальной инфекции.

В контексте реализации подпункта «г» пункта 21 Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации (№ 145, утверждённая Указом Президента РФ от 28 февраля 2024 года) планируется разработка технологии производства вакцины с живыми аттенуированными вирусными штаммами для интраназальной профилактики респираторных заболеваний телят.

Методологический дизайн исследования предусматривает двухэтапный научный подход. Первый этап - селекция вирусных штаммов с комплексным изучением их антигенной активности и иммуногенного потенциала на лабораторных животных. Второй этап - оптимизация технологических параметров производства вакцины, определение иммунизирующей дозы с последующей верификацией иммуногенности на целевом биологическом виде.

Практическая значимость работы заключается в разработке высокоспецифичной импортозамещающей вакцины, направленной на превентивную защиту телят от наиболее распространенных респираторных вирусных инфекций. Предложенная научная стратегия создания вакцины будет демонстрировать потенциал существенного повышения эпизоотического благополучия и экономической эффективности животноводческой отрасли.

Высокие инфекционные титры (4,50-6,17 lg ТЦД50/см3) кандидатных штаммов на перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК свидетельствуют о ее чувствительности к подобранным вирусам и о возможности их использования при разработке технологии изготовления живой аттенуированной импортозамещающей вакцины против ИРТ, ПГ-3, РСИ для профилактики респираторных инфекций молодняка методом интраназальной иммунизации телят с первых дней жизни. Чувствительность ЛЭК ко всем штаммам делает технологически удобным накопление биомассы этих вирусов.