Первичные результаты изучения биотехнологического потенциала эпифитных бактерий, выделенных из Anthriscus sylvestris

Уровень развития агропромышленного сектора напрямую влияет на способность региона обеспечивать себя продуктами питания, а также на его экономическую и политическую устойчивость. Сельское хозяйство играет ключевую роль в производстве качественных продуктов питания, кормов для животных и поддержании экологического баланса [1].

Развитие производства, расширение ассортимента и повышение качествапродукцииживотноводстваневозможнобезнадёжнойкормовой базы. Критически важно, чтобы производство кормов соответствовало климатическимособенностямиприроднымресурсамрегиона, превосходя потребности животноводства [2]. Совершенствование технологий выпуска кормов с высокой пищевой ценностью при одновременном применении экологически безопасных методов ухода за растениями, сохраняющих плодородие почвы, повышает конкурентоспособность аграрного сектора и способствует укреплению продовольственной безопасности [3]. АПК Вологодской области обладает значительным потенциалом и скрытыми резервами, эффективное освоение которых имеет важное значение для продовольственного обеспечения Европейского Севера России.

Производство органической продукции активно развивается, привлекая внимание как исследователей, так и производителей по всему миру. На сегодняшний день органическую продукцию производят 179 стран, а 89 из них обладают собственными нормативно-правовыми актами в этой сфере [4]. В России под органическое земледелие выделено 615,5 тыс. га – это лишь 0,3% от общей площади сельхозугодий. По оценкам Минсельхоза, в стране имеется свыше 10 млн га земель, пригодных для органического земледелия. Стратегическая оценка показывает, что наличие таких территорий создаёт выгодные условия для расширения органического сектора АПК [5], на что обязательно стоит обратить внимание аграриям.

Одной из ключевых задач агропромышленного сектора является повышение урожайности сельскохозяйственных культур. В качестве инструмента для решения этой задачи могут выступать биопрепараты, содержащие бактерии, способствующие стимуляции роста растений – PGPB (PlantGrowthPromotionBacteria). Работы ряда авторов показывают [6-7], что именно ризосферные и эндофитные штаммы, находясь в симбиотических связях с растениями-хозяевами, оказывают заметное воздействие на развитие и урожайность сельскохозяйственных растений [8-9]. В связи с этим поиск новых эффективных штаммов бактерий для создания микробиологических препаратов и разработка технологий их применения представляет собой важное направление сельскохозяйственной микробиологии [10].

У разных растительных семейств различные приспособления для выживания в определенных условиях. Они являются резервуаром биологического потенциала, так как разные штаммы оказывают разное воздействие [11].

Для успешной интеграции биопрепаратов в российскую агропромышленную систему требуется выделение региональных штаммов, адаптированных к местным климатическим и почвенным условиям, а также формирование комплексных систем возделывания растений, сочетающих использование биологических и химических методов в оптимальных пропорциях [12]. Применение биопрепаратов на основе природных антагонистических бактерий не нарушает экологическое равновесие, а их воздействие на патогенные микроорганизмы в почве носит избирательный и длительный характер благодаря способности штаммов колонизировать корни растений [13].

На сегодняшний день у исследователей имеется интерес к аборигенной микрофлоре [14], т.е. к микроорганизмам, извлеченным непосредственно в пределах района применения, преимущественно с местных широко распространенных видов растений. Преимущество таких штаммов заключается в их высокой адаптации к составу почвы, в которой они будут использоваться. Кроме того, такой принцип выбора микроорганизмов, которые в последующем могут стать основой биопрепаратов, исключает введение чужеродных штаммов, способных нарушить структуру экосистемы и стать источником биоценотического загрязнения [15].

Учитывая мировые тенденции развития сельского хозяйства, особенности и потребности АПК Вологодской области, научные исследования лаборатории биоэкономики и устойчивого развития ВолНЦ РАН направлены на поиск перспективных для агропроизводства микроорганизмов и изучение их биотехнологического потенциала. В качестве растительного объекта, микробиом которого служит донором потенциально значимых бактериальных изолятов, выбран купырь лесной ( Anthriscussylvestris (L.) Hoffm.). По своим экологическим характеристикам данный вид предпочитает условия с умереной влажностью, питанием и температурой (является мезоацидофилом и гемиконтрастофилом), что позволяет ему занимать большие территории в условиях Нечерноземной зоны, в т.ч. Вологодской области.

Цель настоящего исследования – изучить биотехнологический потенциал эпифитных бактериальных изолятов, выделенных из различных частей Anthriscussylvestris . Для достижения поставленной цели автором были поставлены следующие задачи: выделить бактериальные изоляты из различных частей A.sylvestris ; провести оценку потенциала данных изолятов в отношении стимуляции роста и развития растений, а также защиты растений от фитопатогенных организмов; отобрать наиболее ценные изоляты для дальнейшей работы.

Материалы и методика исследований

Сбор растительных образцов осуществлялся в рамках выездов в окрестности д. Мухино (Ягановское сельское поселение, Череповецкий округ, Вологодская область). Участок сбора растительных образцов был представлен луговым разнотравным сообществом. Бактерии выделялись из ризосферы и филлосферы купыря в день сбора растительных образцов.

Для сбора растительных образцов растения целиком извлекались из почвы, помещались в стерильный конверт и доставлялись в лабораторию. В лаборатории растение делилось на ризосферную и филлосферную часть. Раствор для посева готовили с использованием растительных образцов и стерильной водопроводной воды. Культивирование бактерий осуществляли на твердой питательной среде LB по Miller в термостате в течение 2–3 суток при температуре 25°С. После инкубации методом истощающего посева отсевали на новые чашки Петри отдельные отличные изоляты.

Оценка биотехнологического потенциала бактерий включала оценкуспособностисинтезироватьфитогормоны(индолы–потенциально индолилуксусную кислоту (ИУК)), фиксировать атмосферный азот, трансформировать фосфаты, проявлять целлюлазную, амилазную и протеазную активности, а также подавлять развитие фитопатогенных организмов (родов Fusarium, Trichoderma,Erwinia , Pseudomonas ).

Оценку способности выделенных бактерий синтезировать ИУК (индолы) осуществлялипутемкультивированиябактерийнапитательной среде LB по Miller с добавлением триптофана (500 мг/л). На 3-е сутки культивирования производили центрифугирование (2 мин на 14000 об/мин.) и фильтрацию (Millipore, 0,22 мкм) культуральной жидкости от бактерий, далее добавляли реактив Сальковского (500:1000 мкл). Оценку содержания индолов осуществляли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм, для расчета количественного содержания анализируемого вещества строили калибровочную кривую на чистом ИУК.

Способность бактерий растворять ортофосфаты кальция оценивали путем культивирования бактерий на глюкозоаспаргиновой среде Муромцева, способность бактерий к фиксации азота – на среде Эшби. Для оценки целлюлозолитической активности использовали среду Гетчинсона, для оценки амилолитической и протеолитической активности также применяли специализированные питательные среды с добавлением соответственно крахмала и казеина. Для проявления зон растворения казеина в чашки после инкубации заливали 10 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, для проявления зон растворения крахмала – разбавленного раствора Люголя.

Способность бактерий подавлять развитие фитопатогенов (родов

Fusarium, Trichoderma,Erwinia ) оценивали путем совместного поверхностного культивирования (метод «бруска»). Культивирование чашек осуществляи при температуре 25 ℃ в течение 2–5 суток. Оценку осуществляли визуально: чем больше зона отсутствия патогена, тем сильнее выражены антагонистические свойства у изучаемого штамма. Лабораторные исследования проводили на базе ЦКП «Центр сельскохозяйственных исследований и биотехнологий» ФГБУН ВолнЦ РАН.

Результаты и обсуждение

В вегетационный период 2025 года в результате экспедиции в окрестности дер. Мухино (Череповецкий округ, Вологодская область) сотрудниками лаборатории были собраны растения, а затем извлечены 27 бактериальных изолятов: 13 – из ризосферы и 14 – из филлосферы. В рамках исследований были получены чистые культуры выделенных изолятов, и проведена оценка их потенциала как в отношении стимуляции роста растений, так и в отношении подавления развития фитопатогенных грибов и бактерий.

Среди 27 бактериальных изолятов 93% обнаруживали способность синтезировать индолы (рисунок 1), при этом 56% способны к их синтезу в количестве 10 мг/л и выше, 33% – в количестве 20 мг/л и выше, 11% – в количестве 30 мг/л и выше, 7% – в количестве 50 мг/л и выше. К изолятам, способным продуцировать ИУК в большом количестве, относятся следующие: КР-08-25 (123,9 мг/л), КР-13-25 (76,6 мг/л), КФ-01-25 (36,7 мг/л), КР-02-25 (28,0), КФ-04-25 (26,3 мг/л), КФ-1125 (26,3 мг/л) иКР-04-25 (24,3 мг/л). Известно, что ауксины участвуют в регуляции клеточного деления и дифференцировки, инициируют прорастаниесемянистимулируютформированиебоковыхипридаточных корней. Удлинение корневой системы расширяет площадь корневого покрова, что повышает эффективность поглощения питательных веществ и обеспечивает растения необходимыми элементами питания [16].

Рисунок 1 – Пример качественной реакции по способности изолятов синтезировать ИУК: А – контроль; Б – КР-08-25; В – КР-13-25; Г – КР-04-25

Среди выделенных их ризо- и филлосферы купыря бактериальных изолятов способностью фиксировать молекулярный азот обладали 70% (рисунок 2А) и 30% – трансформировать фосфаты (рисунок 2Б). При имеющейся способности к азотфиксации, данные изоляты обогащают почву доступными для растений соединениями азота, что экономически выгодно и снижает затраты на дополнительную обработку минеральными удобрениями [17]. Это же касается и содержания фосфора в почве, так как 80-90% фосфатов, вносимых в виде удобрений, сорбируются на почвенных частицах, поэтому фосфор как элемент питания остается малодоступным для растений. Дляповышения его доступности растениям разрабатываются биоудобрения на основе штаммов микроорганизмов, способных мобилизовать нерастворимые почвенные фосфаты [18].

Рисунок 2 – Пример оценки способности изолятов фиксировать молекулярный азот (А: изоляты КР-06-25 и КР-03-25) и трансформировать фосфаты (Б: изоляты КФ-01-25, КР-11-25, КФ-05-25 иКФ-04-25)

Единовременно способностями к трансформации фосфатов, фиксации молекулярного азота и синтезу ИУК обладали 26% изоля-тов (7 шт.). При этом интересными являлись 9 изолятов, отраженных в таблице 1, а наиболее важными – 4 изолята: КФ-01-25, КФ-05-25, КФ-14-25, КР-03-25 (синтез ИУК выше 10 мг/л, при этом они способны к трансформации фосфатов и фиксации азота).

Таблица 1 – Наиболее интересные для стимуляции роста растений изоляты

Наименование штамма	Способность к		Ферментативная активность		Синтез ИУК, мг/л
	Фосфат-мобилизации	Aзот-фиксации	Целлюлозолитическая	Амилолитическая
КФ-01-25	+	+	15 мм	24 мм	36,7
КФ-05-25	+	+	-	-	15,8
КФ-10-25	+	+	11 мм	13 мм	5,0
КФ-14-25	+	+	17 мм	4 мм	10,7
КФ-13-25	+	+	10 мм	6 мм	5,4
КР-01-25	+	+	15 мм	3 мм	6,2
КР-03-25	+	+	-	15 мм	16,4
КР-08-25	усл.	-	-	5 мм	123,9
КР-13-25	-	-	-	15 мм	76,6

Примечание: усл. – результаты неоднозначны, требуют уточнения, но, возможно, бактерии данного штамма имеют изучаемое свойство; «+» – свойство выражено; цифирное значение – количественное значение показателя; «-» – свойство не выражено

Испытания на целлюлозолитическую активность с изолятами важны, поскольку данный показатель может отражать трансформацию органического вещества и косвенно указывать на степень плодородия почв и продуктивности биоты [19]. Амилолитическая реакция – это ферментативныйпроцессрасщеплениякрахмалаидругихполисахаридов до более простых углеводов с помощью ферментов амилаз, которые уже используются бактериями в качестве источника углерода. Крахмал является главным запасным веществом многих экономически значимых растительных культур, таких как картофель, кукуруза, рис, пшеница и др.[20]. Ферменты протеазы в почве обусловливают динамику азота, который в доступной форме выделяется при последовательном расщеплении белковых веществ [21].

Оценка ферментативной активности показала, что среди выделенных в ходе работы изолятов, 74% (20 шт., рисунок 3) проявляли целлюлозолитическую, 89% (24 шт.) – амилолитическую активность. Не обнаружено ни одного штамма способного к сразу трем активностям, так как способностью к двум активностям обладают 19 изолятов. Наиболее активным в отношении целлюлозы оказались следующие изоляты (диаметр зоны гидролиза 20 мм и выше): КФ-0625, КР-04-25, КР-06-25 и КР-07-25, в отношении гидролиза крахмала (диаметр зоны гидролиза 20 мм и выше): КФ-01-25, КФ-02-25, КФ-03-25, КР-09-25. Протеолитическую активность не проявил ни один из штаммов.

Рисунок 3 – Результаты оценки способности изолятов проявлять целлюлозолитическую активность: А – КФ-06-25; Б – КР-04-25

Результаты по изучению антагонизма в отношении рода Trichoder-ma показалинаибольшую эффективность изолятов КФ-01-25 и КР-04-25, в отношении рода Fusarium –КР-04-25, а в отношении рода Erwinia – КФ-10-25(рисунок 4).

Рисунок 4 – Пример оценки способности изолятов проявлять антагонистическую активность: А – КФ-01-25 и КР-04-25 (в отношении Fusarium ); Б – КР-04-25 (в отношении Trichoderma ); В – КФ-10-25 (в отношении Erwinia )

Заключение

Таким образом, наиболее перспективными изолятами с биотехнологическим потенциалом для роста и развития растений можно выделить следующие – КФ-01-25, КФ-05-25, КФ-14-25, КР-03-25 и КР-08-25, а для защиты растений от фитопатогенных организмов – КФ-01-25, КР-04-25 и КФ-10-25. В дальнейшем сотрудниками лаборатории будет продолжена работа с оценкой штаммов на прорастание проростков ячменя и овса на начальных стадиях онтогенеза и проведением реакций для оценки их потенциала для создания биопрепаратов, в первую очередь с целью активации роста и повышения продуктивности зерновых культур.