Первичный скрининг грибных штаммов антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю фомоза подсолнечника (часть 1)

Введение. Одной из серьёзных причин, препятствующих получению стабильно высоких урожаев подсолнечника – основной масличной культуры в Российской Федерации, является ущерб, наносимый болезнями. Все большую вредоносность на подсолнечнике показывает фомоз или черная пятнистость ( Phoma macdonaldii Boerema) [1; 2]. До середины прошлого столетия фомоз не наносил существенного вреда подсолнечнику в России. Так, в условиях Краснодарского края, несмотря на высокое распространение, фомоз не оказывал существенного влияния на урожай и посевные качества семян подсолнечника. Погодные условия в крае способствовали позднему заражению растений болезнью, обычно в фазе цветения, созревания, что связано со значительной гибелью заразного начала при отрицательных температурах в зимний период [3]. В Белгородской области к концу вегетации подсолнечника распространение болезни составляло 100 %, а развитие – до 10 % [4]. Однако в последние 10–15 лет фомоз перешел в разряд экономически значимых болезней культуры, а по распространенности занимает лидирующее положение среди других болезней [5].

Решение проблемы защиты подсолнечника от болезней, в том числе и от фомоза, связано с разработкой комплекса эффективных мероприятий, включающих создание устойчивых сортов и гибридов, разработку элементов технологии возделывания культуры, приемов и методов биологической и химической защиты, снижающих вредоносность болезней.

Основным способом борьбы с болезнями на подсолнечнике является селекционный. Во ВНИИМК исследования по созданию устойчивых сортов и гибридов подсолнечника к возбудителю фомоза уже проводятся. Изучаются биологические особенности возбудителя болезни, разрабатываются методы определения агрессивности изолятов и вредоносности патогена [6; 7].

В лаборатории биометода ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК многие годы ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных культур от болезней. В основе разработанной нами концепции целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты подсолнечника и других сельскохозяйственных культур от болезней, лежит поиск штаммов антагонистов, безопасных для человека, нефитотоксич-ных, проявляющих высокую активность в широко варьируемых условиях против комплекса патогенов, обладающих поли-функциональным типом действия. В результате многолетних исследований создана коллекция перспективных штаммов грибов и бактерий антагонистов широкого круга патогенов, поражающих масличные и другие сельскохозяйственные культуры. Нами установлено, что наиболее приемлемым путём решения проблемы защиты подсолнечника, рапса, сои от возбудителей болезней, инфекционное начало которых сохраняется в почве, является целенаправленное обогащение почвы и растительных остатков пораженных растений антагонистами, обладающими кроме фунгицидных свойств еще и целлюлозоразрушающей активно- стью. Не менее эффективным способом снижения вредоносности болезней является предпосевная обработка семян по-лифункциональными микробиопрепаратами на основе перспективных штаммов-продуцентов с широким спектром действия против комплекса патогенов [8; 9; 10; 11].

В России зарегистрированных микробиопрепаратов против фомоза на подсолнечнике нет. Против фомоза на корнеплодах зарегистрированы два бактериальных биопрепарата: на сахарной свекле БФТИМ КС-2, Ж на основе бактерии Bacillus amyloliquefaciens и на моркови - Фитоспорин-М, Ж, штамм-продуцент Bacillus subtilis [12]. Мы не обнаружили в литературе сведений о разработке биологических мер борьбы с возбудителем фомоза на подсолнечнике. Поэтому целью наших исследований было проведение ступенчатого скрининга штаммов-антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю фомоза на подсолнечнике.

На первом этапе скрининга тестировали грибные штаммы, представленные родами Trichoderma, Penicillium, Chaeto-mium, Trichothecium, Sordaria, Talaromy-ces, Aspergillus, Metarhizium и классом Basidiomycetes, а также бактерии из родов Bacillus и Pseudomonas.

Материалы и методы. Агрессивный изолят возбудителя фомоза Phoma macdonaldii выделен нами из стеблей пораженного подсолнечника на посевах ВНИИМК. Агрессивность изолятов возбудителя фомоза определяли методом «агаровых блоков» разработанным В.Ф. Зайчук (1983 г.) [13]. Для этого семена подсолнечника раскладывали в растильни по 25 штук на увлажненную фильтровальную бумагу с прослойкой ваты, сверху прикладывали агаровый блок с мицелием патогена, размером 3,0 х 4,0 мм и создавали влажную камеру. Повторность опыта 3-кратная. Учет проводили через семь суток после заражения.

Первичный скрининг штаммов-антагонистов из коллекции лаборатории биометода к возбудителю фомоза на подсолнечнике проводили к наиболее агрессивному изоляту методом двойных или встречных культур in vitro [14]. Культуры антагонистов и возбудителя болезни выращивали отдельно в течение пяти дней на агаризированной питательной среде. Стерильным сверлом вырезали блоки с мицелием антагониста и патогена и помещали в одну чашку Петри на расстоянии 6 см. Контролем служили культуры антагонистов и патогена, посеянные порознь. Контроль роста культур производили ежедневно, учеты - на 20-е сутки культивирования. Отмечали рост патогена и антагониста в процентах от площади чашки Петри (конкуренцию за площадь питания). Для этого измеряли площадь зарастания поверхности питательной среды в см2, а затем проводили перерасчет на процент по пропорции, имея ввиду площадь чашки Петри 81,0 см2. Кроме того, отмечали наличие или отсутствие зон задержки роста патогена в результате синтеза гидролитических ферментов или веществ антибиотической природы (диаметр стерильной зоны, мм), а также нарастания антагониста на колонию патогена (площадь гиперпаразитической зоны, см2). Повторность опыта 3-кратная. Антагонистов и патоген выращивали на агаризированных средах: картофельно-сахарозной (КСА) [16], овсяной (ОА) [17], а также на специализированной среде для грибов - Рудакова [18].

Результаты и обсуждение. Результаты оценки антагонистической активности коллекционных грибных штаммов к возбудителю фомоза подсолнечника на трех питательных средах (КСА, Рудакова и ОА) показали, что механизм действия грибов представлен тремя типами:

• -    антагонист занимает значительную поверхность питательной среды - более 50,0 % (конкуренция за площадь питания);

• -    антагонист образует зону нарастания на колонию патогена (гиперпаразитизм);

• -    антагонист образует стерильную зону задержки роста мицелия патогена (антибиоз).

На картофельно-сахарозном агаре изо-лят возбудителя фомоза подсолнечника

Phoma macdonaldii за 20 суток культивирования занял 100 % поверхности питательной среды.

Из 29 испытанных коллекционных грибных штаммов антагонистическую активность к возбудителю фомоза через 20 суток совместного культивирования на КСА проявили 22 штамма. Из них 15 штаммов обладали двойным механизмом действия – конкуренцией за площадь питания и гиперпаразитизмом (табл. 1).

Таблица 1

Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii при температуре 25 °С на 20-е сутки совместного культивирования на картофельно-саха-розном агаре г. Краснодар, ВНИИМК, 2019 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер гипер-парази тичес-кой зоны, см2	Размер сте-риль-ной зоны, мм
	анта-гони-стом	патогеном
Phoma macdonaldii (контроль)	-	100	-	-
Конкуренция за площадь питания + гиперпаразитизм
SM-1 Sordaria sp .	96,2	3,9	2,5	0
T-1 Trichoderma sp.	100	1,7	1,3	0
T-2 Trichoderma sp.	100	2,1	1,7	0
T-3 Trichoderma sp.	100	0,9	1,0	0
T-4 Trichoderma sp.	100	1,2	1,0	0
An-1 Aspergillus niger	98,9	2,0	1,4	0
Pbc-1 P. brevi-compactum	90,0	7,7	1,4	0
Xk-1 Chaetomium olivaceum	73,3	26,2	1,7	0
Tr-1 Trichothecium roseum	82,1	17,9	14,2	0
Xk-2 Chaetomium olivaceum	69,4	30,1	9,8	0
Pf-1 Penicillium funiculosum	65,0	35,0	8,8	0
Pr-1 Penicillium rugulosum	89,7	10,1	8,7	0
Pk-1 Penicillium vermiculatum	65,8	34,1	8,0	0
И-3 Basidiomycetes	73,1	30,8	3,1	0
Af-1 Aspergillus flavus	65,0	37,2	3,3	0
Конкуренция за площадь питания
Pv-3 Penicillium verrucosum	85,0	4,7    1	0 1	0
Гиперпаразитизм
A-1 Basidiomycetes	46,5	53,6	43,4	0
Tt-1 Talaromyces trachispermus	48,5	51,7	4,5	0
Антибиоз
Xk-3 Chaetomium sp.	53,5	26,4	0	12,5
Ma-1 Metarhizium sp.	47,8	41,0	0	8,0
M-24 Penicillium sp.	52,3	44,4	0	3,0
Pp-1 Penicillium pupurescens	50,0	50,0	0	2,0

Следует подчеркнуть, что среди этих антагонистов установлено подразделение на две группы штаммов.

У группы из семи штаммов, относящихся к родам Trichoderma (T-1, T-2, T-3, T-4 Trichoderma sp.), а также Aspergillus (An-1 Aspergillus niger ), Sordaria (SM-1 Sordaria sp.) и Penicillium (Pbc-1 Penicillium brevicompactum ), установлена наибольшая конкурентная способность за площадь питания по отношению к возбудителю фо-моза с небольшой зоной нарастания антагониста на колонию патогена (рис. 1.1).

Во второй группе из восьми штаммов антагонистов, относящихся к родам Trichothecium, Chaetomium, Penicillium, Aspergillus и классу Basidiomycetes , площадь зарастания питательной среды была значительно меньше, при этом патоген успевал занять 10,0–37,2 %, поэтому зона нарастания антагониста на патоген была выше. Максимальная зона нарастания антагониста на колонию патогена отмечена у штамма Tr-1 Trichothecium roseum – 14,2 см² .

У одного штамма антагониста Pv-3 Penicillium verrucosum по отношению к возбудителю фомоза подсолнечника установлена только конкуренция за площадь питания. В двойной культуре этот штамм занял 85,0 % площади питательной среды, не образуя зоны задержки роста патогена.

Гиперпаразитизм установлен у двух грибных штаммов антагонистов, при этом максимальная зона зарастания колонии патогена отмечена у штамма A-1 Basidiomycetes (43,4 см²) (рис. 1.2).

У трех грибных штаммов к возбудителю фомоза определен антибиоз. В двойных культурах с патогеном они образовали стерильную зону задержки роста. Максимальную антибиотическую активность к возбудителю фомоза проявил штамм Xk-3 Chaetomium sp. (рис. 1.3).

Т-1 Trichoderma sp.

A-1 Basidiomycetes

Xk-3 Chaetomium sp.

3 а – антагонист; б – патоген

Рисунок 1 – Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii , через 20 суток культивирования на среде КСА, 2020 г. (ориг.): 1 – конкуренция за площадь питания; 2 – гиперпаразитизм; 3 – антибиотическая активность

Агаризированная среда Рудакова более благоприятна для выращивания штаммов антагонистов, а патоген за 20 суток занял только 42,8 % площади питательной среды. Так же, как и на среде КСА антагони- стическую активность к возбудителю фо-моза проявили 22 коллекционных штамма грибов, из них 16 штаммов обладали двойным механизмом действия (табл. 2).

Таблица 2

Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii при температуре 25 0С на 20-е сутки совместного культивирования на среде Рудакова г. Краснодар, ВНИИМК, 2019 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер гипер-парази-тичес-кой зоны, см2	Размер сте-риль-ной зоны, мм
	анта-гони-стом	патогеном
Phoma macdonaldii	-	42,8	-	-
Конкуренция за площадь питания + гиперпаразитизм
Pk-1 Penicillium vermiculatum	100	29,9	15,0	0
Pr-1 Penicillium rugulosum	100	14,4	14,4	0
Тк-1 Trichoderma koningii	100	14,7	11,9	0
Pf-1 Penicillium funiculosum	80,6	27,3	10,7	0
Tr-1 Trichothecium roseum	91,9	8,2	8,2	0
Xk-1 Chaetomium olivaceum	83,3	16,7	5,0	0
T-4 Trichoderma sp.	100	5,1	4,1	0
An-1 Aspergillus niger	95,9	5,1	4,4	0
Xk-2 Chaetomium olivaceum	84,2	15,8	3,3	0
Ma - 1 Metarhizium sp.	100	3,0	3,0	0
T-2 Trichoderma sp.	100	3,6	2,9	0
SM-1 Sordaria sp.	90,4	9,6	2,7
Xk-3 Chaetomium sp.	85,2	14,9	2,3	0
T-1 Trichoderma sp.	100	2,3	1,9	0
T-3 Trichoderma sp.	100	1,2	1,0	0
Конкуренция за площадь питания
Pp-1 Penicillium purpurescens	100	1,6	0	0
Pbc-1 P. brevi-compactum	100	1,6	0	0
И-3 Basidiomycetes	89,5	10,0	0	0
Tt-1 Talaromyces trachispermus	79,3	20,8	0	0
Гиперпаразитизм
Af-1 Aspergillus flavus	48,4	36,5	4,8	0
Антибиоз
M-24 Penicillium sp.	61,1	27,2	0	5,0
Pv-3 Penicillium verrucosum	80,0	18,6	0	6,0

Все штаммы из этой группы показали высокую конкурентную способность за площадь питания по отношению к патогенному изоляту Phoma macdonaldii . Площадь зарастания среды у этих штаммов антагонистов составила 80,0–100 % (рис. 2.1). Но, в отличие от среды КСА, зона нарастания антагониста на колонию патогена значительно варьировала. Максимальная гиперпаразитическая зона (8,2–15,0 см²) отмечена у пяти штаммов, 107

относящихся к родам Penicillium (Pk-1 P. vermiculatum, Pr-1 P. rugulosum, Pf-1 P. funiculosum ) , а также Trichoderma (Тк-1 Trichoderma koningii ) и Trichothecium (Tr-1 Trichothecium roseum ) (рис. 2.2).

Sm-1 Sordaria sp.

Pr-1 Penicillium rugulosum

M-24 Penicillium sp. 3

а – антагонист; б – патоген

Рисунок 2 – Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза подсолнечника

Phoma macdonaldii , через 20 суток культивирования на среде Рудакова, 2020 г. (ориг.): 1 – конкуренция за площадь питания; 2 – гиперпаразитизм; 3 – антибиоз

У четырех штаммов антагонистов (Pp-1 P. purpurescens, Pbc-1 P. brevi-compactum, И-3 Basidiomycetes и Tt-1 Talaromyces trachispermus ) на среде Рудакова установлена только конкуренция за площадь питания. В двойных культурах эти штаммы заняли 79,3–100 % площади питания, не образуя зон задержек роста патогена.

Штамм Af-1 Aspergillus flavus проявил по отношению к патогену только гиперпаразитизм, с зоной нарастания 4,8 см².

Антибиоз установлен у двух штаммов грибов антагонистов M-24 Penicillium sp. и Pv-3 P. verrucosum. Стерильная зона у этих штаммов составила 5,0–6,0 мм (рис. 2, 3).

На овсяном агаре в контроле возбудитель фомоза подсолнечника за 20 суток культивирования занял 79,0 % поверхности питательной среды (табл. 3).

Таблица 3

Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii при температуре 25 0С на 20-е сутки совместного культивирования на овсяном агаре г. Краснодар, ВНИИМК, 2019 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер гиперпара-зитиче ской зоны, см2	Размер сте-риль-ной зоны, мм
	анта-гони-стом	пато-геном
Phoma macdonaldii	-	79,0	-	-
Конкуренция за площадь питания + гиперпаразитизм
Pbc-1 P. brevi-compactum	100	29,0	12,0	0
SM-1 Sordaria sp.	71,9	28,1	7,2	0
T-2 Trichoderma sp.	100	6,2	5,0	0
Xk-3 Chaetomium sp.	66,7	19,8	5,0	0
Pv-3 Penicillium verrucosum	60,0	50,0	4,0	0
Ma-1 Metarhizium sp.	59,3	60,4	3,1	0
T-1 Trichoderma sp.	100	3,0	2,4	0
Pp-1 Penicillium purpurescens	79,0	31,0	2,3	0
T-3 Trichoderma sp.	100	1,2	2,3	0
Конкуренция за площадь питания + гиперпаразитизм + антибиоз
An-1 Aspergillus niger	81,7	18,3	3,0	10,0
Tt-1 Talaromyces trachispermus	1,2	50,0	3,2	16,0
Конкуренция за площадь питания
Av-1 Aspergillus versicolor	70,0	20,1	0	0
Антибиоз
Xk-2 Chaetomium olivaceum	24,3	17,9	0	25,0
Af-1 Aspergillus flavus	27,1	22,5	0	15,0
И-3 Basidiomycetes	27,2	28,1	0	12,0
М-24 Penicillium sp.	24,7	34,6	0	5,0
Xk-1 Chaetomium olivaceum	66,7	22,9	0	5,0
Tr-1 Trichothecium roseum	58,9	27,7	0	2,0

Антагонистическую активность к возбудителю фомоза на ОА проявили 18 коллекционных штаммов грибов. Из них девять штаммов, относящихся к родам Penicillium, Sordaria, Trichoderma, Chaetomium и Metarhizium , обладали двойным механизмом действия: конкуренцией за площадь питания и гиперпаразитизмом. Как и на среде Рудакова, большинство штаммов антагонистов обладали высокой конкурентной способностью, площадь зарастания среды составила 59,3–100 % (рис. 3.1). Размер гиперпаразитической зоны во всех вариантах был невысоким (2,3–7,2 см²) (рис. 3.2), за исключением варианта со штаммом Pbc-1 P. brevi-compactum , у которого зона нарастания на патоген составила 12,0 см² .

Sm-1 Sordaria sp.

Т-2 Trichoderma sp. Xk-2 Chaetomium

2                 olivaceum а – антагонист; б – патоген

Рисунок 3 – Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii , через 20 суток культивирования на ОА, 2020 г. (ориг.): 1 – конкуренция за площадь питания;

2 – гиперпаразитизм; 3 – антибиоз

У штаммов An-1 Aspergillus niger и Tt-1 Talaromyces trachispermus установлен тройной механизм действия к возбудителю фомоза: конкуренция за площадь питания, гиперпаразитизм и антибиоз.

Только конкуренция за площадь питания к патогену установлена у штамма Av-1 Aspergillus versicolor.

У шести антагонистов из родов Chaetomium, Aspergillus, Penicillium и Trichothecium и класса Basidiomycetes на среде ОА установлен антибиоз, размер стерильной зоны составил 2,0–25,0 мм. Максимальная стерильная зона (25,0 мм) отмечена у штамма Xk-2 Chaetomium olivaceum (рис. 3.3).

Выводы . В результате оценки 29 коллекционных грибных штаммов на трех питательных средах КСА, Рудакова и ОА установлено, что 23 штамма обладали антагонистической активностью с одним или несколькими типами механизма действия против возбудителя фомоза подсолнечника.

Двойным механизмом действия (конкуренцией за площадь питания и гиперпаразитизмом) обладал 21 штамм грибов антагонистов. Из них пять штаммов (SM-1 Sordaria sp., T-1, T-2, T-3 Trichoderma sp. и Pbc-1 P. brevi-compactum ) проявили активность на трех питательных средах. Площадь зарастания среды у этих штаммов антагонистов составила 80,0–100 %, при размерах гиперпаразитической зоны 1,0–5,0 см². Максимальная гиперпаразитическая зона отмечена у штаммов: A-1 Basidiomycetes (43,4 см²) на КСА; Pk-1 P. vermiculatum (15,0 см²) на среде Рудакова; Tr-1 Trichothecium roseum (14, 2 см²) на КСА и Pbc-1 P. brevi-compactum (12,0 см²) на ОА.

Только конкуренцией за площадь питания на трех средах обладали восемь грибов антагонистов. При этом только штамм Av-1 Aspergillus versicolor обладал одним механизмом действия (конкуренцией за площадь питания) на двух питательных средах КСА и ОА.

Антибиотическая активность установлена у восьми грибных антагонистов. При этом только штамм M-24 Penicillium sp.

обладал одним механизмом действия (антибиозом) на двух питательных средах КСА и Рудакова. Максимальная стерильная зона к возбудителю фомоза отмечена у штаммов: Xk-3 Chaetomium sp. (12,5 мм) на КСА, An-1 Aspergillus niger (10,0 мм) на ОА, Pv-3 Penicillium verrucosum (6,0 мм) на среде Рудакова.

Таким образом, в результате первичного скрининга 29 коллекционных грибных антагонистов против возбудителя фомоза подсолнечника антагонистическая активность установлена у 23 штаммов.

Штаммы грибов антагонистов, выделенные на первом этапе, будут оценены во вторичном скрининге, на фоне искусственного заражения возбудителем фомо-за в лабораторных условиях во влажной камере и в грунте.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ и администрации Краснодарского края р_ Наставник № 19-416-235003 .