Первичный скрининг микроорганизмов-антагонистов к микроскопическим грибам Aspergillus flavus и Fusarium sporotrichioides

В период вегетации растения поражают микромицеты, представленные в основном родами Alternaria, Helminthosporium, Cladosporium и Fusarium. Видовой и количественный состав грибной флоры в процессе хранения растительного сырья и кормов меняется, замещаясь сапрофитными грибами родов Aspergillus, Penicillium, Mucor и другими, при этом виды рода Fusarium орпр-прспособны при благоприятных условиях и к дальнейшему развитию. Наибольшую опасность среди «полевых» грибов и «плесеней хранения» для живых организмов представляют виды Aspergillus и Fusarium тем, что выделяют токсичные метаболиты [3]. В связи с этим корма, контаминированные микроскопическими грибами и их токсинами не могут быть использованы в корм без соответствующей обработки. Все чаще в последнее время для борьбы с грибковыми болезнями сельскохозяйственных культур находят применение в интегрированной системе защиты растений препараты на основе микроорганизмов-антагонистов.

Разработка эффективных микробиологических средств защиты растений и кормов от микроскопических грибов предполагает изучение характера взаимодействия микробов-антагонистов с микромицетами. В связи с этим целью исследования явилась оценка антагонистического потенциала почвенных микроорганизмов в отношении грибов Aspergillus flavus и Fusarium sporotrichioides.

Материалы и методы. Использовали как музейные (М), так и полевые штаммы (ПШ) микроскопических грибов Aspergillus flavus и Fusarium sporotrichioides. Выделение чистой культуры гриба проводили с поверхности семян зерновых культур согласно методическим указаниям и ГОСТ [1, 4, 5]. Вы- ращивание грибов проводили на среде Чапека и сусло-агаре.

Первичный скрининг штаммов, рассматриваемых в качестве возможных антагонистов микроскопических плесневых грибов, проводили методом совместного культивирования тестовых микромицетов с пробами почвы, ризосферы, вегетативных органов и семян зерновых культур (пшеницы, кукурузы). Для этого пробы гомогенизировали в стерильном физиологическом растворе и осуществляли посев на агар Чапека предварительно засеянный тест - культурами грибов – музейного штамма и выделенного с зерен пшеницы. Через 96 часов инкубирования при 260С колонии, вокруг которых наблюдались зоны задержки роста тестовых штаммов, отбирали и высевали в новые чашки. Отдельные наиболее характерные морфологически различающиеся колонии использовали для получения чистой культуры (изолят).

Противогрибковую активность отобранных изолятов исследовали методом встречных культур [2]. Культуру гриба и антагониста в виде «пятачков» бактериологической петлей наносили на сусло-агар в чашке Петри, на расстоянии 6 см друг от друга. Контролем служил посев гриба без изолята. Чашки инкубировали в термостате при 260С, учет проводили на 5; 10; 15 и 30 сутки культивирования. Отмечали рост тест-гриба и антагониста, характер их взаимодействия.

Степень ингибирования роста мицелия гриба определяли по формуле [7]:

И = (1 – (А / В)) × 100, где

И –% ингибирования;

А – рост гриба в варианте;

В – рост гриба в контроле.

Взаимоотношения патогена и антагониста характеризовали по классификации Пестинской Т.В. [6].

Результаты исследований. При совместном культивировании проб с тестовыми микромицетами Aspergillus flavus выделили 9 изолятов: РКА1 из ризосферы кукурузы, РПА2, РПА3 и РПА6 - из ризосферы пшеницы, ПА4, ПА5, ПА7, ПА8 и ПА9 – из почвы.

В результате исследования противогрибковой активности методом встречных культур отобранные изоляты по механизму действия отнесли к штаммам, проявляющим фунгистатический антибиотический антагонизм (I тип), т. е. ингибирование роста гриба происходило на расстоянии под воздействием антибиотических веществ с образованием между культурами пустой, «стерильной» зоны (табл. 1); и штаммам с фунгистатическим алиментарным антагонизмом (III тип), выражающемся в остановке роста гриба при контакте с колонией антагониста, а также в нарастании последнего на патоген (табл. 2).

Таблица 1 – Активность изолятов, образующих стерильную зону антагонистического действия в отношении микромицета Aspergillus flavus

Изолят	Степень ингибирования роста мицелия, %
	Срок культивирования, сут
	Музейный штамм		Полевой штамм
	15	30	15	30
РКА1	50,8	51,2	51,1	51,5
РПА2	38,2	36,4	39,3	36,6
ПА4	47,3	47,5	47,0	47,6
ПА5	33,7	33,1	34,0	33,3
РПА6	36,5	36,3	36,9	36,5
ПА7	50,1	50,4	50,0	50,9
ПА9	34,6	33,0	34,9	33,4

Изоляты РКА1, ПА4 и ПА7 проявили высокую противогрибковую активность в отношении микромицета Aspergillus flavus, которая сохранялась до конца срока культивирования. Изоляты РПА2, ПА5, РПА6 и ПА9 имели среднюю степень ингибирования роста мицелия исследуемого гриба, понижающуюся со временем. Активность изоля-тов в отношении полевого и музейного штамма существенного отличия не имела.

Таблица 2 – Активность изолятов, ингибирующих развитие микромицета Aspergillus flavus

Изолят	Степень ингибирования роста мицелия, %
	Срок культивирования, сут
	Музейный штамм		Полевой штамм
	15	30	15	30
РПА3	56,7	58,3	56,0	58,1
ПА8	58,7	60,0	59,2	61,7

Что наибольшей противогрибковой активностью в течение всего срока культивирования обладали изоляты РПА3 и ПА8, блокирующие развитие мицелия патогена, занимая большую площадь питательной среды.

В зоне антагонистического действия изолятов РКА1, ПА7 и ПА8 гриб не сформировал воздушный мицелий, а сформировавшийся мицелий подвергался лизису. Активность изолятов в отношении полевого и музейного штамма существенного отличия не имела.

Следовательно, наиболее перспективными антагонистами грибов Aspergillus flavus и изолятами с высокой ферментативной активностью при первичном исследовании являются РКА1, РПА3, ПА4, ПА7и ПА8.

При совместном культивировании проб с тестовыми микромицетами Fusarium sporotrichioides выделили 11 изолятов: РПF1, РПF2 и РПF3 – из ризосферы пшеницы, ПF4, ПF5, ПF6 и ПF7 – из почвы, РКF8, РКF9, РКF10 и РКF11 – из ризосферы кукурузы.

Высокую противогрибковую активность в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides проявили изоляты РПF1,РПF2 и РКF9, которая сохранялась до конца срока культивирования, среднюю степень ингиби- рования роста мицелия гриба имели изоляты РПF3 и ПF6. Наименьшая активность отмечена у изолятов ПF4, ПF5 и РКF10, к 30-м суткам культивирования патоген начал преодолевать действие изолятов и разрастаться на занимаемой ими площади (табл. 3).

Таблица 3 – Активность изолятов, образующих стерильную зону антагонистического действия в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides

Изолят	Степень ингибирования роста мицелия, %
	Срок культивирования, сут
	Музейный штамм		Полевой штамм
	15	30	15	30
РПF1	54,9	55,1	55,2	55,5
РПF2	49,6	50,3	50,0	50,6
РПF3	43,5	44,0	43,0	44,0
ПF4	37,7	36,0	37,6	36,1
ПF5	39,4	39,4	39,7	40,0
ПF6	45,0	45,7	45,3	46,4
РКF9	56,4	58,0	56,2	58,7
РКF10	38,5	35,2	39,0	35,9

Фунгистатическим алиментарным антагонизмом обладали изоляты ПF7, РКF8 и РКF11, к 30-м суткам культивирования их степень ингибирования развития гриба по- вышалась, мицелий подвергался лизису. Активность изолятов в отношении полевого и музейного штамма микромицета существенного отличия не имела (табл. 4).

Таблица 4 – Активность изолятов, ингибирующих развитие микромицета Fusarium sporotrichioides

Изолят	Степень ингибирования роста мицелия, %
	Срок культивирования, сут
	Музейный штамм		Полевой штамм
	15	30	15	30
ПF7	61,4	64,2	62,0	65,3
РКF8	57,6	60,6	57,2	60,9
РКF11	62,3	65,0	62,1	65,4

Таким образом, наиболее перспективными антагонистами грибов Fusarium sporotrichioides и изолятами с высокой ферментативной активностью являются РПF1, РПF2, ПF7, РКF8, РКF9 и РКF11.

Выводы . В результате скрининга изо-лятов, выделенных из природных биотопов, установлена антагонистическая активность некоторых из них в отношении микромице-тов Aspergillus flavus и Fusarium sporotrichioides. Наличие фунгистатического алиментарного антагонизма отмечали во взаимоотношениях изолятов РПА3, ПА8 с грибом Aspergillus flavus, фунгистатическим антибиотическим антагонизмом обладали изоляты РКА1, ПА4, ПА7. В отношении Fusarium sporotrichioides алиментарный антагонизм показали ПF7, РКF8, РКF11. Антибиотический антагонизм был характерен изолятам РПF1, РПF2, РКF9.

Работа выполнена при поддержке ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (Фонд содействия инновациям) в рамках выполнения Соглашения о предоставлении гранта на выполнение научноисследовательских работ за №10244ГУ/2015.

Резюме

Проведен первичный скрининг микроорганизмов, выделенных из природных биотопов, на предмет антагонистической активности в отношении микроскопических грибов Aspergillus flavus и Fusarium sporotrichioides методом совместного культивирования и встречных культур. Наиболее перспективными изолятами, проявившими противогрибковый эффект в отношении микромицета Aspergillus flavus, для использования как основа биофунгицидов в качестве живых культур являются РПА3 и ПА8, синтезирующими противогрибковые вещества – РКА1, ПА4, ПА7. Высокую противогрибковую активность в отношении гриба Fusarium sporotrichioides и потенциал использования как основа биофунгицидов в качестве живых культур показали ПF7, РКF8 и РКF11, противогрибковые вещества синтезировали изоляты РПF1, РПF2 и РКF9.