Первичный скрининг штаммов-антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю фузариоза льна масличного

Введение. Наиболее вредоносной болезнью льна масличного, которая поражает культуру во всех регионах выращивания на протяжении всего периода вегетации, является фузариоз. Решение проблемы защиты льна масличного от болезней, в том числе и от фуза-риоза, связано с разработкой комплекса эффективных мероприятий, включающих создание устойчивых сортов, разработку элементов технологии возделывания культуры, снижающих вредоносность болезней, приемов и методов химической и биологической защиты.

Успешность микробиологического метода во многом определяется выбором микроорганизмов-антагонистов. Поэтому поиск таких штаммов продолжает оставаться актуальной задачей.

Учёные ВНИИМК занимались разработкой микробиологической защиты масличных культур от фузариоза. В лаборатории биометода установлен видовой состав возбудителей фузариоза на подсолнечнике. Создана коллекция перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепаратов – бактерий из родов Bacillus и Pseudomonas . На основе четырёх перспективных штаммов бактерий разработаны эффективные, полифунк-циональные микробиопрепараты [1; 2; 3]. В лаборатории также проведены исследования по разработке микробиологических мер борьбы с фузариозом на сое. Выделены штаммы-продуценты микробиопрепаратов из рода Chaetomium, Bacillus и Pseudomonas , снижающие вредоносность фузариоза сои [4].

Несмотря на наличие в нашей стране зарегистрированных микробиопрепаратов в отношении фузариоза на других культурах, на льне таких препаратов нет. В литературе имеются публикации по испытанию микробиопрепаратов на льне. Так, в условиях Курганской области на льне-долгунце против фузариоза испытывали два биопрепарата: Интеграл (штамм-продуцент Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ И-11008 и гуматы) и Ризоплан (штамм-продуцент Pseudomonas fluores-cens AP-33) [5]. Также на льне-долгунце испытывали незарегистрированный биопрепарат ВТН10 (штамм-продуцент Bacillus thuringiensis H10) против возбудителей фузариоза [6]. В Белоруссии для защиты от фузариоза льна масличного испытывали биопрепараты: Триходермин БЛ, на основе штамма Trichoderma viride Т13-82 и Фунгилекс, Ж, на основе штамма Trichoderma sp. [7].

Настоящая работа посвящена первичному скринингу штаммов-антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к одному из наиболее распространенных и агрессивных видов возбудителя фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai.

Материалы и методы. Исследования проведены в 2018–2019 гг. Объектом исследований служили антагонисты возбудителей болезней масличных культур из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК: 24 грибных и 36 бактериальных, а также возбудитель фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai. Определение возбудителя фузариоза проводили по определителю Билай [8].

Согласно методике ступенчатого скрининга, разработанной в лаборатории биометода [9], первичную оценку антагонистической активности in vitro проводили к наиболее распространенным и вредоносным возбудителям болезней методом двойных или встречных культур [10]. Культуры антагонистов и возбудителя болезни выращивали отдельно в течение пяти дней на агаризированной питательной среде. Стерильным сверлом вырезали блоки с мицелием антагониста и патогена и помещали в одну чашку Петри на расстоянии 6 см. Контролем служили культуры антагонистов и патогена, посеянные порознь. Учёты проводили на десятые сутки культивирования. Отмечали рост патогена и антагониста в процентах (%) от площади чашки Петри (конкуренцию за площадь питания), наличие или отсутствие зон задержки роста патогена, в результате синтеза гидролитических ферментов или веществ антибиотической природы (стерильная зона, мм), нарастания антагониста на колонию патогена (гиперпаразитическая зона, см²). Антагонистов и патоген выращивали на картофельно-сахарозном агаре (КСА) [11] и на специализированных средах: для грибов – Рудакова [12], бактерий из рода Bacillus – Тайлона-3 [10], из рода Pseudomonas – Кинга В [13].

Результаты и обсуждение. Из 24 испытанных штаммов грибов-антагонистов наибольшую антагонистическую активность по отношению к патогенному возбудителю фузариоза F. oxysporum var. orthoceras на двух питательных средах 94

(КСА и Рудакова) показали четыре штамма рода Trichoderma (T-1, T-2, T-3 и T-4 Trichoderma sp. ), обладающие двойным механизмом действия – конкуренцией за питательную среду и гиперпаразитизмом (табл. 1, рис. 1). Площадь зарастания среды у этих штаммов составила 67,2–77,7 %, а размер гиперпаразитической зоны – 19,1–26,6 см².

Таблица 1

Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var.

orthoceras при температуре 25 оС на 10-е сутки совместного культивирования на картофельно-сахарозном агаре и среде Рудакова г. Краснодар, ВНИИМК, 2019 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер гиперпа-разити-ческой 2 зоны, см	Размер сте-риль-ной зоны, мм
	антагонистом	патогеном
Картофельно-сахарозный агар
Fusarium oxysporum var. orthoceras (контроль)	-	100	-	-
SM-1 Sordaria sp.	87,0	13,0	2,1	0
T-3 Trichoderma sp.	77,7	22,3	19,3	0
T-2 Trichoderma sp.	74,8	25,2	20,4	0
Tk-1 Trichoderma koningii	72,6	27,4	3,3	0
Av-1 Aspergillus versicolor	72,2	27,8	20,0	0
T-1 Trichoderma sp.	70,4	29,6	24,0	0
T-4 Trichoderma sp .	67,2	32,8	26,6	0
A-1 Basidiomycetes	60,5	39,5	32,0	0
Xk-1 Chaetomium olivaceum	55,0	45,0	12,0	3,0
Xk-1 Chaetomium olivaceum	45,0	55,0	18,0	0
Pv-3 Penicillium verrucosum	24,2	55,6	0	5,0
Среда Рудакова
Fusarium oxysporum var. orthoceras (контроль)	-	100	-	-
SM-1 Sordaria sp.	90,3	9,7	1,2	0
Pv-3 Penicillium verrucosum	88,8	14,8	3,5	0
A-1 Basidiomycetes sp.	85,2	14,8	12,0	0
T-3 Trichoderma sp.	85,2	14,8	12,0	0
T-2 Trichoderma sp.	80,5	19,4	15,8	0
T-1 Trichoderma sp.	77,5	22,5	18,2	0
T-4 Trichoderma sp.	76,2	23,8	19,3	0
Tk-1 Trichoderma koningii	68,0	32,0	0	3,0
И-3 Basidiomycetes	55,6	44,4	36,0	0
Pr-1 Penicillium rugulosum	23,8	61,1	0	10,0

Рис. 1

Максимальную конкурентную способность за площадь питания проявили штаммы SM-1 Sordaria sp. на обеих питательных средах и Pv-3 Penicillium verrucosum на среде Рудакова (площадь зарастания среды – 87,0–90,3 % и 88,8 % соответственно). Также высокую конкурентную способность проявил на обеих средах штамм Tk-1 Trichoderma koningii, площадь зарастания среды – 72,6–68,0 %. Максимальную гиперпаразитическую зону образовали штаммы A-1 Basidiomycetes (32,0 см²) на среде КСА и И-3 Basidiomycetes (36,0 см²) на среде Рудакова. Антибиотическую активность проявили отдельные грибные штаммы, при этом максимальная стерильная зона (10,0 мм) отмечена у Pr-1 P. rugulosum на среде Рудакова и Pv-3 P. verrucosum (5,0 мм) на среде КСА.

Из 27 коллекционных штаммов бактерий рода Bacillus выделены 11, проявивших высокую антагонистическую активность к F. oxysporum var. orthoceras (табл. 2, рис. 2).

Таблица 2

Антагонистическая активность штаммов бактерий рода Bacillus к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras при температуре 25 оС на 10-е сутки совместного культивирования на картофельно-сахарозном агаре и среде Тайлона г. Краснодар, ВНИИМК, 2019 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер стерильной зоны, мм
	антагонистом	патогеном
Картофельно-сахарозный агар
Fusarium oxysporum var . orthoceras (контроль)	-	100	-
Fa 4-1 Bacillus subtilis	98,8	1,2	0
11-3 Bacillus sp.	97,5	2,5	6,0
D 1-1 Bacillus sp.	36,5	18,5	20,0
3-2 Bacillus sp .	1,2	32,1	20,0
D 7-1 B. subtilis	7,1	33,3	12,0
D 7-3 B. subtilis	2,5	68,0	10,0
Б-2 B. circulans	4,0	30,9	7,0
Среда Тайлона
Fusarium oxysporum var . orthoceras (контроль)	-	100	-
11-3 Bacillus sp.	84,9	15,1	0
Fz 9 Bacillus sp.	5,4	16,0	10,0
5Б-1 B. subtilis	6,5	57,4	5,0
01 корf Bacillus sp .	3,2	68,2	5,0

На среде КСА два штамма бактерий (Fa 4-1 Bacillus subtilis и 11-3 Bacillus sp. ) проявили высокую конкуренцию за площадь питания (площадь зарастания среды – 97,5–98,8 %). При этом у штамма 11-3 установлена и антибиотическая активность (размер стерильной зоны 6,0 мм). У пяти штаммов бактерий из рода Bacillus (D 1-1 и 3-2 Bacillus sp ., D 7-1 и D 7-3 B. subtilis, Б-2 B. circulans ) установлена только антибиотическая активность (размер стерильных зон составил 7,0–20,0 мм). Максимальная стерильная зона (20,0 мм) установлена у штаммов D 1-1 и 3-2 Bacillus sp .

На специализированной для бактерий рода Bacillus среде Тайлона высокую конкуренцию за площадь питания проявил штамм 11-3 Bacillus sp. , у которого площадь зарастания среды составила 84,9 %. У трех штаммов отмечена только антибиотическая активность (Fz 9 и 01 корf Bacillus sp. , 5Б-1 B. subtilis ), размер стерильных зон составил 5,0–10,0 мм. Максимальная стерильная зона (10 мм) отмечена у штамма Fz 9 Bacillus sp.

Из девяти коллекционных штаммов бактерий рода Pseudomonas в двойных культурах с возбудителем фузариоза у шести установлена антибиотическая активность, размер стерильных зон составил 5,0–14,0 мм. При этом у пяти штаммов антибиотическая активность отмечена на обеих питательных средах (табл. 3, рис. 3).

Табл.2

Таблица 3

Антагонистическая активность штаммов бактерий рода Pseudomonas к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras при температуре 25 оС на 10-е сутки совместного культивирования на картофельно-сахарозном агаре и среде Кинга В

Oif 2-1 Pseudomonas sp.

а

Sgrc-1 P. fluorescens

б

Рисунок 3 – Антибиотическая активность штаммов бактерий рода Pseudomonas к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras через 10 суток совместного культивирования, 2019 г. (ориг.): а – на среде КСА;

б – на среде Кинга В

г. Краснодар, ВНИИМК, 2019 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер сте-риль-ной зоны, мм
	антагонистом	патогеном
Картофельно-сахарозный агар
Fusarium oxysporum var. orthoceras	-	100	-
Oif 2-1 Pseudomonas sp.	5,6	63,3	14,0
16-2 Pseudomonas sp.	3,7	61,1	12,0
Sgc-1 Pseudomonas sp.	11,9	52,2	11,0
14-4 Pseudomonas sp.	4,2	61,1	10,0
12-2 Pseudomonas sp.	10,4	55,6	8,0
15-1 Pseudomonas sp.	6,2	55,2	6,0
Среда Кинга В
Fusarium oxysporum var. orthoceras	-	80.0	-
15-1 Pseudomonas sp.	8,6	55,6	9,0
Sgrc-1 P. fluorescens	5,0	50,0	7,0
16-2 Pseudomonas sp.	3,3	61,1	7,0
14-4 Pseudomonas sp.	9,3	55,6	6,0
Sgc-1 Pseudomonas sp.	4,4	70,0	5,0
12-2 Pseudomonas sp.	2,2	43,2	5,0

Контроль

Fusarium oxysporum var. orthoceras а                     б

Более высокая активность штаммов бактерий рода Pseudomonas установлена на среде КСА, размер стерильных зон составил 6,0–14,0 мм. При этом максимальная зона (14,0 мм) установлена у штамма Oif 2-1 Pseudomonas sp. На среде Кинга В выявлена антибиотическая активность у шести штаммов псевдомонад (15-1, 14-4, 16-2, 12-2, Sgc-1 Pseudomonas sp., Sgrc-1 P. fluorescens ) при этом размер стерильных зон был значительно меньше, чем на среде КСА (5,0–9,0 мм).

Штаммы грибов и бактерий-антагонистов, выделенные на первом этапе, будут оценены во вторичном скрининге, на фоне искусственного заражения семян льна возбудителями фузариоза в лабораторных условиях in vitro и в почве.

Выводы. Из 24 коллекционных штаммов грибов-антагонистов наибольшую активность по отношению к патогенному возбудителю фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras на двух питательных средах (КСА и Рудакова) проявили 10. Высокую активность показали четыре штамма из рода Trichoderma (T-1, T-2, T-3, T-4 Trichoderma sp. ), обладающие двойным механизмом действия – конкуренцией за питательную среду и гиперпаразитизмом. Максимальную конкурентную способность за площадь питания проявили штаммы SM-1 Sordaria sp., Pv-3 Penicillium verrucosum и Tk-1 Trichoderma koningii. Максимальную гиперпаразитическую зону образовали штаммы A-1 и И-3 Basidiomycetes. Максимальная антибиотическая активность отмечена у штамма Pr-1 Penicillium rugulosum.

Из 27 коллекционных штаммов бактерий рода Bacillus выделены 11, проявивших наибольшую антагонистическую активность к патогену. При этом только 11-3 Bacillus sp. показал высокую активность сразу на двух питательных средах (КСА и Рудакова). Высокую конкурентную способность за площадь питания проявили два штамма: Fa 4-1 Bacillus subtilis и 11-3 Bacillus sp. У восьми штаммов отмечена только антибиотическая активность (D 1-1, 3-2, Fz 9, 01 корf Bacillus sp ., D 7-1, D 7-3, 5Б-1 B. subtilis , Б-2 B. circulans ). Максимальная стерильная зона

(10 мм) отмечена у штамма Fz 9 Bacillus sp.

Из девяти коллекционных штаммов бактерий из рода Pseudomonas у шести установлена только антибиотическая активность, при этом у пяти она отмечена на обеих питательных средах. Более высокая активность штаммов псевдомонад установлена на среде КСА, размер стерильных зон составил 6,0–14,0 мм. При этом максимальная зона (14,0 мм) установлена у штамма Oif 2-1 Pseudomonas sp.