Подбор эффективного инактиванта и адъюванта при конструировании инактивированной вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота
Автор: Красочко П.А., Овчинникова В., Черных О.Ю., Лысенко А.А., Белоусов В.И., Шарыпов А.С.
Статья в выпуске: 3 т.243, 2020 года.
Бесплатный доступ
Статья посвящена сравнительному изучению и подбору эффективных адъювантов при конструировании вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота. Продемонстрирована эффективность различных адъювантов на лабораторных моделях (белые мыши), также отработаны режимы инактивации, изучено действие различных инактивантов на вирус диареи и осуществлен подбор необходимой концентрации инактиванта.
Штамм, адъювант, культура клеток, пневмоэнтериты, вирусная диарея
Короткий адрес: https://sciup.org/142225993
IDR: 142225993 | DOI: 10.31588/2413-4201-1883-243-3-143-147
Текст научной статьи Подбор эффективного инактиванта и адъюванта при конструировании инактивированной вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота
В структуре заболеваемости сель- экономическое значение имеют вирусные скохозяйственных животных наибольшее пневмоэнтериты молодняка и патологии органов воспроизводства маточного поголовья крупного рогатого скота (КРС), проявляющиеся бесплодием, ранней эмбриональной смертностью и абортами. Одним из доминирующих возбудителей этих заболеваний является вирус вирусной диареи – болезни слизистых (ВД-БС) КРС [3].
По результатам исследований ветеринарных лабораторий Российской Федерации инфицированность крупного рогатого скота вирусом вирусной диареи в ряде случаев достигает 32 %, эпизоотические штаммы ВД выделяются из патматериала в 5,1 % случаев, из мертворожденных телят в 7 % случаев. В Республике Беларусь за последние годы выделение из исследуемого материала ВД составила 60-80 %. Вирусная диарея КРС носит, как правило, стационарный характер с поражением 10100 % животных и гибелью 10-90 % заболевших в неблагополучном очаге [3].
Подсчитанные потери в стаде во время вспышек болезни могут варьировать от нескольких тысяч до 100 000 долларов США, в инфицированном стаде – от 24 до 200 долларов на одну корову в год. На уровне индустрии в целом они могут рассчитываться уже в национальном масштабе [1, 5, 8]. Большие потери складываются из снижения молочной и мясной продуктивности, недополучения приплода от коров и сокращения срока использования животных. Переболевшие животные остаются вирусоносителями и источниками инфекции в стаде [4, 7]. Телята, рожденные от этих коров, становятся пожизненными вирусоносителями. Отмечают врожденные аномалии развития и диарею у новорожденных телят [2].
Эффективная программа биобезопасности при ВД-БС крупного рогатого скота предусматривает 3 принципа: 1 – создание напряженного иммунитета; 2 – предотвращение риска инфицирования животных вирусом ВД-БС КРС (особенно коров во время репродуктивного цикла); 3 – удаление персистентных инфицированных животных-носителей, служащих резервуаром вируса, из стада. Создание иммунитета достигается вакцинацией. В США насчитывается более 180, в Республике Беларусь – 19 моно- и ассоциирован- ных вакцин против ВД-БС [1, 7]. Для проведения вакцинации против ВД-БС в год Республике требуется до 3,0 млн. доз вакцины, которая закупается, главным образом в России и Голландии, на что тратятся значительные валютные средства.
Цель настоящего исследования: провести подбор эффективных адъювантов при конструировании вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота.
Материал и методы исследований. Исследования проводились на базе отдела вирусных инфекций РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» и кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней животных УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины».
Накопление вируса диареи проводили на культуре клеток МДБК. Для работы использован штамм вируса диареи КМИЭВ – 7.
Для отработки режимов инактивации штаммов вируса диареи в качестве инактивантов использованы теотропин и формалин в различных концентрациях (от 0,1 до 0,5 %).
В заранее оттитрованную вируссо-держащую жидкость были добавлены различные разведения инактивантов. Экспозиция контакта вирусного штамма с инак-тивантом составляла 24, 48, 72, 96 и 120 часов. Через 6, 12, 24, 36 и 48 часов отбирались пробы материала и контролировались на полноту инактивации в культурах клеток при проведении 2-3 пассажей.
Для отработки адъювантов были использованы следующие адъюванты: гидроокись алюминия с сапонином, эмуль-сиген и эмульсиген Д, монтанид ИЗА-70 и ИЗА-206, хитозана сукцинат. Для этого в культуральную жидкость с инактивированным вирусом диареи вносили адъюванты в различных концентрациях.
Для оценки их эффективности исследования проводились на белых мышах, которым вводили по 0,2 мл смеси вируса и адъюванта двукратно с интервалом в 14 дней. Через 21 день после последнего введения вируса с адъювантом от животных брали кровь. Титр антител определяли в
РНГА.
Результаты исследований. Для определения антигенной активности выделенных штаммов вируса диареи в сравнении с производственными штаммами ви- руса диареи исследования были проведены на белых мышах. Для изучения этого было использовано 35 белых мышей, которых разделили на 7 групп по 5 голов в каждой (Таблица 1).
Таблица 1 – Результаты изучения действия различных инактивантов на вирус диареи
|
№ п/п |
Концентрация инактиванта |
Время контакта c инактивантом (часы) |
Вирус диареи |
|
|
Время проявления ЦПД (часы) |
Результат |
|||
|
Формалин |
||||
|
1 |
0,1 % |
24 |
24 |
++++ |
|
2 |
0,1 % |
48 |
24 |
++++ |
|
3 |
0,2 % |
24 |
24 |
++ |
|
4 |
0,2 % |
48 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
5 |
0,3 % |
24 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
6 |
0,3 % |
48 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
7 |
0,4 % |
24 |
12 (дегенерация клеток) |
- |
|
8 |
0,4 % |
48 |
12 (дегенерация клеток) |
- |
|
9 |
0,5 % |
24 |
12 (дегенерация клеток) |
- |
|
10 |
0,5 % |
48 |
12 (дегенерация клеток) |
- |
|
11 |
Контроль формалина 0,1 % |
- |
- |
- |
|
12 |
Контроль формалина 0,2 % |
- |
24 (дегенерация клеток) |
+ |
|
13 |
Контроль формалина 0,3 % |
- |
24 (дегенерация клеток) |
+++ |
|
14 |
Контроль формалина 0,4 % |
- |
12 (дегенерация клеток) |
++++ |
|
15 |
Контроль формалина 0,5 % |
- |
12 (дегенерация клеток) |
++++ |
|
Теотропин |
||||
|
16 |
0,1 % |
24 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
17 |
0,1 % |
48 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
18 |
0,2 % |
24 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
19 |
0,2 % |
48 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
20 |
0,3 % |
24 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
21 |
0,3 % |
48 |
Отсутствие ЦПД |
- |
|
22 |
0,4 % |
24 |
24 (дегенерация клеток) |
- |
|
23 |
0,4 % |
48 |
12 (дегенерация клеток) |
- |
|
24 |
0,5 % |
24 |
12 (дегенерация клеток) |
- |
|
25 |
0,5 % |
48 |
12 дегенерация клеток) |
- |
|
26 |
Контроль теотропина 0,1 % |
- |
- |
- |
|
27 |
Контроль теотропина 0,2 % |
- |
- |
- |
|
28 |
Контроль теотропина 0,3 % |
- |
- |
- |
|
29 |
Контроль теотропина 0,4 % |
- |
24 (дегенерация клеток) |
- |
|
30 |
Контроль теотропина 0,5 % |
- |
12 (дегенерация клеток) |
- |
Мышам 1 группы был введен изо-лят вируса диареи № 1, инактивированный теотропином внутримышечно в дозе 0,25 мл, мышам 2 группы – изолят вируса диареи № 1, инактивированный формалином, мышам 3 группы был введен изолят вируса диареи № 2, инактивированный теотропи-ном, мышам 4 группы – изолят вируса диареи № 2, инактивированный формали- ном, мышам 5 группы – вирус диареи штамм КМИЭВ-7, инактивированный теотропином, мышам 6 группы был введен вирус диареи штамм КМИЭВ 7, инактивированный формалином, 7 группа – контроль. Через 21 день после введения вируса диареи с различными инактивантами у мышей была отобрана кровь путем декапитации. После получения сыворотки определили уровень специфических анти- тел в реакции непрямой гемагглютинации.
Таблица 2 – Антигенная активность инактивированного и не инактивированного штамма вируса диареи
|
Группы животных |
Изолят вируса диареи |
Инактивант |
Титр антител |
|
Опытная группа № 1 |
№ 1 |
Формалин |
1:64 |
|
Опытная группа № 2 |
Теотропин |
1:128 |
|
|
Опытная группа № 5 |
№ 2 |
Формалин |
1:128 |
|
Опытная группа № 6 |
Теотропин |
1:256 |
|
|
Опытная группа № 13 |
Вирус диареи инактивированный КМИЭВ-7 |
Формалин |
1:8 |
|
Опытная группа № 14 |
Теотропин |
1:16 |
|
|
Контрольная группа (плацебо) |
- |
0 |
Подбор наиболее эффективного адъюванта при конструировании вакцины проводился на белых мышах. Для этого были использованы следующие адъюванты: гидроокись алюминия с сапонином, эмульсиген и эмульсиген Д, монтанид ИЗА-70 и ИЗА-206, хитозана сукцинат. Опыты проводились на белых мышах, из которых сформировано 6 групп по 5 голов в группе.
Эмульсиген вносили в количестве 10 %, монтаниды (ИЗА-70) – 50 %, 6 % взвесь гидроокиси алюминия с сапонином – 30 % к объему, хитозана сукцинат – 0,5 %.
Каждый изучаемый адъювант испытывали с инактивированными теотро-пином компонентами вирусов и бактерий.
Образцы компонентов вакцины с различными адъювантами вводили мышам подкожно в дозе 0,25 мл дважды с интервалом 14 дней. Через 21 день после второго введения компонентов животные были обескровлены для получения сыворотки и определения уровня противовирусных антител в РНГА. В таблице 3 представлены результаты изучения инактивированных компонентов с адъювантами.
Таблица 3 – Результаты изучения титров антител при подборе адъювантов при конструировании вакцины против вирусной диареи
|
Группы животных |
Вирусный антиген |
Адъювант |
Количество мышей в группе |
Титр антител (log 2 ) |
|
Опытная группа № 1 |
Вирус диареи, инактив. |
- |
5 |
3,0 |
|
Опытная группа № 2 |
Эмульсиген 10 % |
5 |
5,0 |
|
|
Опытная группа № 3 |
6 % гидроксал с сапонином |
5 |
5,0 |
|
|
Опытная группа № 4 |
ИЗА-70 50 % |
5 |
4,0 |
|
|
Опытная группа № 5 |
Хитозана сукцинат 0,5% |
5 |
5,0 |
|
|
Контрольная группа |
– |
5 |
0 |
Заключение. Таким образом, введение мышам инактивированного теотро-пином вируса диареи с различными адъювантами вызывает биосинтез антител различного уровня. Наиболее активными адъювантами явились эмульсиген, хитозана сукцинат и гидроксал с сапонином.
Резюме
Статья посвящена сравнительному изучению и подбору эффективных адъювантов при конструировании вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота. Продемонстрирована эффективность различных адъювантов на лабораторных моделях (белые мыши), также отработаны режимы инактивации, изучено действие различных инактивантов на вирус диареи и осуществлен подбор необходимой концентрации инактиванта.
Список литературы Подбор эффективного инактиванта и адъюванта при конструировании инактивированной вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота
- Биологические препараты для профилактики вирусных заболеваний животных: разработка и производство в Беларуси / П.А. Красочко [и др.] - Минск, 2016. - 492 с.
- Биотехнологические основы конструирования и использования иммунобиологических препаратов для молодняка крупного рогатого скота / П.А. Красочко // Автореф. дис. д. биол. наук; Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук. - Щёлково, 2009. - 439 с.
- Глотов, А.Г. Вирусная диарея -болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота: обзор литературы / А.Г. Глотов // Ветеринария. - 2008. -№ 6. - С. 5660.
- Дифференциальная диагностика болезней животных: практическое пособие / А.И. Ятусевич [и др.]. - Минск, 2010. -449 с.
- Иванова, И.П. Инфицированность стад крупного рогатого скота возбудителями респираторных инфекций в хозяйствах Минской области / И.П. Иванова, П.А. Красочко // Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных: материалы Международной научнопрактической конференции, посвященной 70-летию со дня образования БелНИИЭВ им. С.Н. Вышелесского / Белорусский НИИ экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. - Минск, 2000. - С. 105-106.
- Стеценко, В.И. Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по вирусным пневмоэнтеритам молодняка крупного рогатого скота в хозяйствах Украины/ В.И. Стеценко, З.Р. Троценко // Ветеринарная медицина 85. - Харьков, 2005. - Т. 2. - С. 1041-1045.
- Средства специфической профилактики инфекционных болезней крупного рогатого скота и свиней: практическое пособие / П.А. Красочко [и др.]; ред. П.А. Красочко. - Минск: ИВЦ Минфина, 2018. - 368 с.
- Шульпин, М.И. Выявление возбудителя вирусной диареи с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации / М.И. Шульпин // Автореф. дис.. канд. биол. наук: 03.00.06. Федеральный центр охраны здоровья животных. - Владимир, 2004. -26 с.
